王 瑜，徐廣民，曾 思，張 鵬，雷 遷

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610072)

腦缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)腦細胞及神經(jīng)元對持續(xù)性缺血的耐受，可能會預(yù)防和保護缺血再灌后的腦損傷[1，2]。有研究證實了腦缺血預(yù)處理(IPC)誘導(dǎo)耐受現(xiàn)象的器官普遍性[3]。研究發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)源性物質(zhì)，也可以誘導(dǎo)類似腦缺血耐受的發(fā)生，例如脂多糖(LPS)預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受，顯示有部分神經(jīng)保護作用，但其作用機制尚不清楚[4～6]。2016年9月至2018年9月我院開展研究，探討脂多糖應(yīng)答分子LRG參與內(nèi)毒素預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受的作用機制，為臨床治療腦缺血性疾病提供可行性理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料①實驗動物：健康8周齡C57雄性小鼠80只，清潔級，體重(22±3)g，購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所。②實驗試劑：MTT、LPS、DMSO(Escherichia coli，O111：B4)均購自于美國Sigma公司；0.25%Trypsin-0.02%EDTA、DMEM/F12、抗生素均購自于賽默飛公司；胎牛血清購自四季青公司；小鼠TNF-α、IL-6、TNF-1β ELISA試劑盒均購自深圳達科為生物技術(shù)有限公司。③實驗儀器：帶針縫合線(中國強生醫(yī)療器械有限公司)；AL104電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司公司)；SZM45體視顯微鏡(深圳博宇)； R4100酶聯(lián)免疫檢測儀(Dynateeh，美國)；超聲細胞破碎儀(Sonics&Meterials公司)；MicroCL 21R 離心機(Thermo Scientific，德國)；power PAC 2000電泳儀(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠腦皮質(zhì)原代細胞神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取新生健康小鼠(<24 h)，75%冰乙醇浸泡10 min，在無菌環(huán)境下斷頭處死，快速取出大腦組織，置于冷的D-PBS中。將0.25%胰蛋白酶加入到徹底剪碎的腦組織中充分消化后，用DMEM-F12(含10%FBS)培養(yǎng)制成單細胞懸液。再將其接種在培養(yǎng)瓶中(密度1×106個/ml)，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，將種植液換成神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)維持培養(yǎng)，隔3天以半量神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基換液(實驗方法參照文獻[7])。

1.2.2LPS預(yù)處理后檢測神經(jīng)元細胞中LRG分子的蛋白水平 分離出純化的神經(jīng)元細胞，在6孔板上以1×106/孔的密度做細胞培養(yǎng)，并分為control組、LPS直接刺激組、LPS預(yù)刺激組。其中預(yù)刺激組先用0.01 μg/ml脂多糖預(yù)刺激18 h，然后用1 μg/ml脂多糖再刺激6、24、48 h。將RIPA裂解液加入收集細胞，4 ℃裂解30分鐘，12000 ×g 4 ℃離心，上清即為蛋白液。BCA試劑盒測樣品蛋白濃度，調(diào)濃度均一化。上樣同等量蛋白樣電泳，80 v恒壓電泳2 h后，進行電轉(zhuǎn)膜，17 V恒壓轉(zhuǎn)膜30 分鐘，封閉液封閉4 h，后加入特異性脂多糖應(yīng)答分子一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3次，每次5分鐘，然后加入對應(yīng)的二抗，重復(fù)上述的孵育和清洗過程，洗去未結(jié)合的二抗，最后X射線膠片曝光分析，利用Image J軟件分析灰度值。

1.2.3體外神經(jīng)元缺血再灌注模型的建立 將LRG表達下降的神經(jīng)元細胞，野生型神經(jīng)元細胞放入密閉恒溫裝置，細胞培養(yǎng)液換為不含糖的人工腦脊液(NaCl 123 mmol/L，KCl 3.75 mmol/L，KH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，MgCl21 mmol/L，CaCl22 mmol/L，pH 7.4)。溫度為(30±2)℃，混合氣體組成為5%CO2、94%N2和1% O2，10 min后培養(yǎng)液更換為有10 mmol/L葡萄糖的人工腦脊液，將細胞置于培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)1小時構(gòu)建出缺血再灌注模型。

1.2.4神經(jīng)元細胞細胞活性的檢測 取96孔板，將3組細胞接種于板子上(密度8×103)，每孔100 μl。均設(shè)置3個復(fù)孔，每個孔再加入20 μl MTT溶液(5 g/L MTT溶于PBS中)，37 ℃孵育4 h(避光)，丟棄上清，每個孔再加入100 μl DMSO，振蕩10 min，待藍紫色結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度，以檢測各組神經(jīng)元的活細胞數(shù)量。

1.2.5檢測LPS預(yù)處理后小鼠腦缺血再灌注模型中LRG的變化 ①小鼠腦缺血再灌注模型的建立：隨機數(shù)字表法將30只C57雄性小鼠分為3組，LPS預(yù)處理+腦缺血再灌注(MCAO)模型組10只小鼠，建立模型前3天，腹腔注射200 μl 0.2 mg/kg LPS(E.coli 0111：B4，L-2630，Sigma)；腦缺血再灌注(MCAO)模型組10只小鼠，注射200 μl無菌生理鹽水；上述兩組小鼠，均術(shù)前12 h禁食，采用大腦中動脈線栓法(MCAO)[7]，小鼠大腦中動脈缺血1 h后，恢復(fù)血流，建立再灌注24 h模型。假手術(shù)對照組10只小鼠，術(shù)前12 h禁食，僅分離頸總動脈，不做缺血處理，其余操作均同手術(shù)組。②Western Blot檢測腦組織中LRG蛋白水平的變化：再灌后24 h，麻醉小鼠，取小鼠大腦組織用PBS(pH 7.4)灌流，清洗干凈后，充分剪碎并加入裂解液裂解1 h，組織勻漿后12000×g 4 ℃，再離心10分鐘，上清即為蛋白液。BCA蛋白定量試劑盒測定LRG蛋白濃度，統(tǒng)一濃度為5 μg/μl。上樣同等量蛋白樣品電泳，80 V恒壓電泳2 h后，進行電轉(zhuǎn)膜，17 V恒壓轉(zhuǎn)膜30分鐘，封閉液封閉2-4小時，后加入特異性脂多糖應(yīng)答分子一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3 次，每次5分鐘，然后加入對應(yīng)的二抗，重復(fù)上述的孵育和清洗過程，洗去未結(jié)合的二抗，最后X射線膠片曝光分析，利用Image J軟件分析灰度值。

1.2.6檢測LRG基因沉默型小鼠腦缺血再灌注損傷 ①尾靜脈注射LRG RNAi慢病毒載體，構(gòu)建針對LRG基因沉默型小鼠8只，野生型C57雄性小鼠8只，采用前述方法建立MCAO模型。假手術(shù)組C57雄性小鼠8只，不做缺血處理。②神經(jīng)功能評分。手術(shù)完畢，待小鼠自然蘇醒后，重新放回鼠籠，給予自由飲食。達到24小時后，根據(jù)Garcia評分法[8]評價并記錄分數(shù)。③Western Blot檢測腦組織中LRG蛋白水平的變化。采用1.2.5中的方法，檢測各組之間神經(jīng)系統(tǒng)中腦組織脂多糖應(yīng)答分子的蛋白表達水平。④ELISA試劑盒檢測血清中炎性因子IL-1β，IL-6，TNF-α的水平。再灌注24 h后，摘眼球取血于1.5 ml EP管中。室溫靜置2 h后，3000 rpm，4 ℃離心10分鐘，上清液即為血清，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中備用。采用ELISA試劑依次檢測血清中IL-6，IL-1β，TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS預(yù)處理后不同時間點刺激神經(jīng)元表達LRG的水平Western Blot檢測各組神經(jīng)元表達LRG的水平，結(jié)果顯示，與control組比較，LPS直接刺激組神經(jīng)元細胞表達LRG水平顯著增加(P< 0.05)；與LPS直接刺激組比較，LPS預(yù)處理組LRG表達水平下調(diào)(P< 0.05)。LPS預(yù)處理后再刺激6、24、48 h神經(jīng)元表達LRG水平均降低(P< 0.05)，但隨著時間的增加，LRG表達水平增加，呈時間依賴性，見圖1。

圖1 LPS預(yù)處理后對神經(jīng)元細胞表達LRG的蛋白水平

2.2 LRG表達下降型神經(jīng)元在體外缺血再灌模型中的細胞活力利用MTT法檢測不同組在體外缺血再灌后神經(jīng)細胞活性發(fā)生的變化。結(jié)果表明，與假手術(shù)對照組(101.6±3.7)比較，神經(jīng)元細胞在腦缺血再灌注(MCAO)模型組(39.7±6.4)中，細胞活力下降(P< 0.01)。與腦缺血再灌注(MCAO)模型組比較，LRS預(yù)處理+腦缺血再灌注(MCAO)模型組(53.3±4.2%)中神經(jīng)元細胞活力較好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。

2.3 LPS預(yù)處理小鼠腦缺血再灌注模型中LRG的表達水平Western Blot檢測小鼠腦缺血再灌模型組腦組織的LRG蛋白表達水平。與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型組LRG蛋白表達水平顯著增加(P< 0.05)。與MCAO模型組比較，LPS預(yù)處理+MCAO模型組LRG蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

2.4 LRG基因沉默型小鼠神經(jīng)功能的影響腦缺血再灌注24 h后，假手術(shù)組中行為學(xué)結(jié)果顯示，神經(jīng)功能評分0分，沒有神經(jīng)功能缺損癥狀。MCAO模型組中小鼠神經(jīng)功能缺損(2.89±0.39)，行為異常，差異顯著(P< 0.01)。與MCAO模型組比較，LRG基因沉默型小鼠+MCAO模型組小鼠神經(jīng)功能評分較低(1.77±0.61)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。

圖2 不同組中腦組織表達LRG的水平

2.5 LRG基因沉默型對腦缺血再灌模型小鼠中LRG蛋白水平的影響腦缺血再灌注24 h后，Western Blot檢測腦組織中LRG的表達水平。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型組中LRG表達水平顯著上調(diào)。與MCAO模型組比較，LRG基因沉默型小鼠模型組LRG表達水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同組中腦組織表達LRG的水平比較

2.6 LRG基因沉默型小鼠腦缺血再灌組血清中其炎性因子IL-1β，TNF-α和IL-6變化利用ELSIA試劑盒檢測血清中其炎性因子IL-1β，TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對照組作比較，MCAO模型組中IL-1β、TNF-α、IL-6均顯著增加(P<0.05)。與MCAO模型組比較，LRG基因沉默型+MCAO模型組中IL-1β、TNF-α、IL-6均顯著下調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 LRG基因沉默型小鼠腦缺血再灌注后血清IL-1β，TNF-α和IL-6的變化

*與假手術(shù)對照組比較，P< 0.01；與MCAO模型組比較，#P< 0.05，##P< 0.01

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一類腦血流供應(yīng)受阻，缺血所致腦組織缺血缺氧引起的腦組織損傷引發(fā)的神經(jīng)元凋亡及炎癥反應(yīng)，最終影響機體神經(jīng)功能的一類復(fù)雜腦血管性疾病。腦缺血再灌注是腦受損，神經(jīng)功能缺失的主要原因。腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生率、死亡率呈上升趨勢，形勢不容樂觀。非缺血性預(yù)處理是當前研究熱點之一，內(nèi)毒素LPS預(yù)處理對腦缺血損傷耐受的交叉誘導(dǎo)和保護作用具有較好療效，但確切機制的研究沒有突破性進展，同時LPS預(yù)處理存在毒性和副作用，在臨床上應(yīng)用存在困難[9，10]。

腦缺血再灌注過程中伴隨有炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生是神經(jīng)元功能性損傷的關(guān)鍵原因。再灌注發(fā)生時，腦血管內(nèi)皮破損，氧自由基爆發(fā)，加重氧化應(yīng)激的反應(yīng)，激活炎癥細胞，促使大量炎性因子釋放入血[11～13]。其中炎性因子TNF-α能夠激活中性粒細胞，使之與白細胞粘附，募集，促進白細胞分泌大量粘附分子，加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致腦組織持續(xù)損傷。IL-1β的爆發(fā)性釋放可以使內(nèi)皮細胞激活，表達分泌粘附分子ICAM-1等，進一步募集大量炎癥細胞到缺血組織區(qū)，加重腦組織缺血損傷[14，15]。

作為炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要分子LPS，其在腦組織缺血再灌注中刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用機制尚不明確。LPS預(yù)處理可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，增強機體缺血耐受。既然LPS預(yù)處理在臨床上不易實現(xiàn)，本研究探討了脂多糖應(yīng)答分子LRG在腦缺血再灌中的作用機制。結(jié)果顯示，LRG基因沉默在腦缺血發(fā)生時，LRG表達下調(diào)，可以減緩腦缺血再灌損傷。同時血清中炎性因子含量減少，炎癥反應(yīng)減少，表明LRG基因沉默可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，增強機體腦缺血耐受，保護腦組織。但是LRG調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用機制通路仍有待深入研究，只有完全明確LRG在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，增強缺血耐受發(fā)揮腦保護作用，才能在臨床上探索替代LPS預(yù)處理的治療腦缺血再灌注的策略。