翟 俊,王 熔,黃澤金,王泉峰,劉文博,陳怡璇

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異化Mn(IV)還原菌激活及其對有機藥物去除

翟 俊1*,王 熔1,黃澤金2,王泉峰1,劉文博1,陳怡璇1

(1.重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院,重慶 400044；2.中國市政工程西北設(shè)計研究院有限公司陜西分院,陜西 西安 710075)

以嘉陵江沉積物為菌源,利用熒光絕對定量(qPCR)技術(shù)探究了不同碳源(葡萄糖和乙酸鈉)和不同形態(tài)的錳氧化物(δ-MnO2和錳礦粉)對異化Mn(IV)還原菌激活效果的影響.在此基礎(chǔ)上,研究了激活效果最佳的異化Mn(IV)還原菌對卡馬西平、布洛芬、萘普生、雌激素和雙氯芬酸5種有機藥物的去除效果.結(jié)果表明,葡萄糖作為碳源,δ-MnO2作為電子受體時激活效果最佳,Mn2+10d累計生成濃度達416.03mg/L,TOC消耗率達88.24%.激活后的異化金屬還原菌在有無外加碳源時對卡馬西平和布洛芬均無明顯去除,對萘普生在外加碳源時能實現(xiàn)11.88%的去除.雌二醇和雙氯芬酸可以作為異化Mn(IV)還原菌唯一碳源,其去除率可達75.70%和58.25%.

異化Mn(IV)還原；有機藥物；生物去除；qPCR

有機藥物廣泛應(yīng)用于制藥、工業(yè)、畜牧以及人們的日常生活中[1],主要包含抗生素、激素、消炎藥、抗癲癇藥、降血脂藥物等.未被吸收和利用的有機藥物可以通過尿液、糞便等途徑排入市政污水中.傳統(tǒng)城鎮(zhèn)污水處理工藝如活性污泥、人工濕地、生物膜法對有機藥物去除效果通常十分有限[2-4],普通生物處理工藝對其去除率大多低于50%[5].目前世界各地水體中都頻繁檢出ng/L~μg/L級別的有機藥物[6-7].盡管水體中有機藥物濃度較低,但其具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)對生態(tài)環(huán)境和人體健康具有潛在的持久性影響[8].一些處理工藝如高級氧化法、活性炭吸附能夠?qū)τ袡C藥物有較高的去除率.有研究表明,UV/ H2O2法對39種有機藥物的去除效率可達90%[9],粉末活性炭對雌酮、雌二醇、甲氧芐氨嘧啶和卡馬西平的去除率可達70%~80%[10].但這些技術(shù)通常受到條件控制復(fù)雜、材料成本高等方面的限制,無法得到大規(guī)模的應(yīng)用.

異化Mn(IV)還原菌是廣泛存在于厭氧環(huán)境(土壤和沉積物)中的一類細菌,在厭氧或缺氧條件下,能以Mn(IV)氧化物作為最終電子受體將其還原為Mn(II),這一過程可偶聯(lián)多種有機物的氧化,其對生態(tài)修復(fù)有著重要的意義.目前相關(guān)研究主要集中在重金屬治理方面和對有機物的降解如染料和芳香族化合物方面[11-12].異化Mn(IV)還原菌可使放射性金屬得到固定[13],亦可將Cr(VI)還原為毒性較低的Cr(III)[14].同時異化Mn(IV)還原菌能高效降解偶氮染料和蒽醌染料[15],亦能以多種苯系物為C源生長[16-17].但關(guān)于異化Mn(IV)還原菌降解有機藥物方面鮮有報道.

因此,本文結(jié)合qPCR技術(shù)探究不同C源及不同的錳氧化物對異化Mn(IV)還原菌還原特性和豐度的影響,得出最佳激活條件.利用最佳激活條件激活后的異化Mn(IV)還原菌群,探究在僅添加有機藥物和同時添加葡萄糖作為外加碳源時對卡馬西平、布洛芬、萘普生、雌二醇、雙氯芬酸的去除效果.研究結(jié)果可為有機藥物的處理提供一個新的思路,同時可更好地理解自然環(huán)境中異化Mn(IV)還原菌在有機藥物遷移轉(zhuǎn)化中的作用.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑:實驗所需有機藥物為分析純,購于Sigma-ALdrich公司.色譜純的甲醇、乙腈購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司.δ-MnO2根據(jù)Murray[18]的方法制備,天然錳礦粉末主要成分為鈣錳礦,使用前利用超純水反復(fù)清洗烘干.

主要儀器:高效液相色譜儀(Agilent 1260,美國Agilent公司),空氣恒溫振蕩器(ZHWY-200H,上海智誠公司),熒光PCR儀(Icycler,美國Bio-Red公司),核酸濃度測定儀(NanoDrop 2000,美國Thermo Fisher Scientific公司),紫外分光光度計(UV2550,島津公司),TOC分析儀(TOC-LCPN,島津公司).

菌源:嘉陵江支流清水溪的4個不同地點的河底沉積物(1~2m),采集后在厭氧工作站中將4個點的沉積物進行充分混合作為菌源使用.

培養(yǎng)基:NH4Cl 0.5g/L,CaCl2·2H2O 0.07g/L, MgSO4·7H2O 0.3g/L,K2HPO4·3H2O 0.722g/L, KH2PO40.25g/L, 1%礦物質(zhì)溶液和1%維生素溶液[19].接種前,培養(yǎng)基高壓滅菌,冷卻后,在超凈工作臺中曝氮氣去除液體中含有的溶解氧以保持厭氧狀態(tài).

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 微生物激活試驗 異化Mn(IV)還原菌激活實驗根據(jù)外加碳源和電子受體的不同分為4組,每組實驗設(shè)置3個平行,如表1所示.反應(yīng)過程利用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值.在一定時間取樣測定水中的Mn2+和TOC的濃度以及異化Mn(IV)還原菌的絕對豐度.

表1 異化Mn(IV)還原菌激活實驗設(shè)置

表2 有機藥物去除實驗設(shè)置

1.2.2 異化Mn(IV)還原菌對有機藥物的去除實驗 以激活異化Mn(IV)還原菌激活效果最好的葡萄糖—δ-MnO2組(詳見2.2)的培養(yǎng)物作為菌源進行有機藥物的去除實驗.去除實驗根據(jù)是否接種細菌和外加碳源設(shè)置為3組,每組實驗設(shè)置3個平行,如表2所示.在一定時間取樣測各反應(yīng)體系中Mn2+及有機藥物的濃度.

1.3 實驗測試方法

1.3.1 有機藥物測試方法 檢測反應(yīng)體系中各有機藥物濃度時,先將樣品用0.22μm濾頭過濾,再進行HPLC分析.HPLC測試方法參考文獻[20]方法,具體測試條件為:進樣量20μL;色譜柱為Zorbax EcLipse XDB-C18 (150mm′4.6mm, 3μm),柱溫30℃;流速: 0.8mL/min;流動相為乙腈和25mmol/L磷酸二氫鉀(梯度淋洗,詳見表3);檢測波長為卡馬西平284nm,萘普生230nm,布洛芬205nm,雌二醇200nm,雙氯芬酸205nm.

表3 梯度洗脫程序

1.3.2 異化金屬還原菌豐度測試方法

②目的片段PCR擴增:選用引物分別對地桿菌、梭菌、芽孢桿菌、厭氧粘細菌的16S rRNA基因片段的PCR擴增,具體引物和序列見表4.PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包括12.5μL 2xTaq MasterMix,9.5μL ddH2O,1μL上游引物,1μL下游引物和1μLDNA模板.PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性:95℃ 1min30s;變性:94℃ 20s,退火:相應(yīng)退火溫度30s,延伸:72℃ 40s,循環(huán)40次;延伸:72℃,10min.

③菌落PCR鑒定陽性克隆與質(zhì)粒提取:將回收的目的片段與pGM-T載體進行連接,利用TOP10感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,涂布于含有氨芐青霉素(AMP)的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)8h.挑取陽性克隆,并在含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng).抽提攜帶目的片段的重組質(zhì)粒,對提取完的質(zhì)粒進行濃度測定.

④qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將重組質(zhì)粒利用ddH2O依次稀釋從101~109進行10倍梯度稀釋,以稀釋后的質(zhì)粒作為DNA模板進行qPCR擴增,反應(yīng)體系為Genstar 2X ReaLStar Power SYBR Mixture 15μL.實驗采用三步法擴增,預(yù)變性95℃ 3min;95℃ 15s,相應(yīng)退火溫度30s,72℃ 30s,40個循環(huán).根據(jù)重組質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值,與其在熒光定量中每個梯度對應(yīng)的C值做標(biāo)準(zhǔn)曲線.

表4 細菌引物

1.3.3 Mn2+和TOC測試方法 Mn2+的測試方法采用高碘酸鉀氧化分光光度法,具體方法參照標(biāo)準(zhǔn)方法[25].TOC測試方法參照文獻[26].

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計分析,利用Origin 8.5.1 軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源和電子受體對異化Mn(IV)還原菌激活的影響

自然界河流沉積物中微生物豐富多樣,其中異化金屬還原菌通過還原Fe(III)/Mn(IV)對有機物進行氧化是各種水生沉積物、淹沒土壤和含水層中有機物氧化的重要機制[19].Fe(III)/Mn(IV)還原菌利用電子供體的能力勝過硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌,因此其能限制在某些土壤、水生沉積物中產(chǎn)生硫化物和甲烷[27-29].因此,將河流沉積物取回后給予特定的培養(yǎng)條件——適宜濃度的有機碳源、Mn(IV)氧化物及營養(yǎng)元素、適宜的溫度和pH值, Mn(IV)還原菌會抑制硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌,優(yōu)先利用有機碳源,因而可馴化和富集異化Mn(IV)還原菌[30].在激活過程中,不同的碳源和不同形態(tài)的電子受體均會對異化金屬還原菌群落和金屬還原量產(chǎn)生影響[31-32].

2.1.1 激活過程Mn2+和TOC的變化 在激活過程中,乙酸鈉—δ-MnO2組、乙酸鈉—MnO2組、葡萄糖—δ-MnO2組和葡萄糖—MnO2組中Mn2+在10d后的累計濃度分別為179.15, 41.34, 416.03, 82.69mg/L,TOC消耗率分別為71.77%,52.08%, 88.24%,65.27% (圖1).由此可知,以δ-MnO2為電子受體,葡萄糖為C源時異化Mn(IV)還原效果最佳.相較于錳礦粉而言,δ-MnO2是無定型的高純度錳氧化物,其粒度在數(shù)十nm的范圍內(nèi)[33],遠小于以鈣錳礦為主要成分的天然錳礦.同時,δ-MnO2具有巨大的比表面積,可以更好的實現(xiàn)電子在錳礦與異化Mn(IV)還原菌之間電子的傳遞.而天然錳礦中的成分較為復(fù)雜,其它成分的存在,一定程度上阻礙了MnO2與細菌的接觸,從而降低了Mn(IV)的還原效果.因此,δ-MnO2更適合作為異化Mn(IV)還原菌的電子受體.而葡萄糖作為電子供體不僅能夠為發(fā)酵型的異化Mn(IV)還原菌提供電子,而且發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸(例如乙酸)還能夠進一步為呼吸型的異化Mn(IV)還原菌提供電子進行Mn(IV)還原.因此,當(dāng)電子受體相同的情況下,葡萄糖作為碳源時比醋酸鈉能夠得到更好的異化Mn(IV)還原激活效果.例如,易維結(jié)[34]在研究葡萄糖、乙酸鹽、丙酮酸鹽和乳酸鹽這4種C源對稻田土中的鐵還原過程的影響時,發(fā)現(xiàn)細菌對葡萄糖的選擇依賴性最強,而乙酸鹽的效果最差.另外,在反應(yīng)前期的1~3d, 4組反應(yīng)體系中Mn2+濃度累積十分緩慢,但TOC在這段時間消耗較快(圖1),這可能是因為激活初期各反應(yīng)體系中的TOC消耗主要是被厭氧發(fā)酵細菌所利用,而隨著異化Mn(IV)還原菌的逐漸激活,后期TOC主要被異化Mn(IV)還原菌所利用.

C—時刻TOC濃度(mg/L);0—初始時刻TOC濃度(mg/L)

2.1.2 激活過程異化Mn(IV)還原菌豐度的變化 圖2為不同反應(yīng)體系中4種常見的異化金屬還原菌的豐度變化情況,初始時每克風(fēng)干沉積物的4種菌的拷貝數(shù)分別是5.792′107,0.794′107, 162.415′107,4.304′107. 4種菌分布廣泛,功能具有多樣性[29,35-36],其中地桿菌和厭氧粘細菌是呼吸型異化Mn(IV)還原菌,能夠以乙酸鹽為唯一C源生長,但是不能利用葡萄糖作為C源,而芽孢桿菌和梭菌是發(fā)酵型異化Mn(IV)還原菌,能高效利用葡萄糖[37].由圖2可以看出,地桿菌和厭氧粘細菌在乙酸鈉—δ-MnO2組中生長最好,其豐度在第10d分別增長為原始的6.6倍和1.6倍.芽孢桿菌和梭菌在葡萄糖—δ-MnO2組中生長最好,第10d分別增長為原始的1.5倍和2.9倍.

當(dāng)乙酸鈉作為C源時,呼吸型的地桿菌和厭氧粘細菌能以乙酸鹽為唯一C源進行生長得到快速增殖.而發(fā)酵型的芽孢桿菌在反應(yīng)初期由于對乙酸鈉的競爭能力弱于地桿菌,其豐度發(fā)生了一定的降低,反應(yīng)后期,可能由于沉積物中本身含有的復(fù)雜性化合物的厭氧發(fā)酵,為其提供了合適的電子供體,細菌數(shù)量呈現(xiàn)出增長.當(dāng)葡萄糖作為C源時,發(fā)酵型的梭菌和芽孢桿菌其生長情況較以乙酸鈉為碳源的反應(yīng)體系好.同時,地桿菌和厭氧粘細菌的數(shù)量也有所增長,這說明在葡萄糖的發(fā)酵過程中,產(chǎn)生的乙酸鹽和H2可以為地桿菌提供電子.因此,以葡萄糖為C源時,發(fā)酵型和呼吸型異化Mn(IV)還原菌可以共同作用,更好的實現(xiàn)Mn(IV)氧化物的還原.當(dāng)C源相同時,δ-MnO2體系中各類異化Mn(IV)還原菌的豐度增長均高于天然錳礦體系.這可能是由于天然錳礦的結(jié)構(gòu)和其中含有的其他雜質(zhì)會影響異化Mn(IV)還原菌與Mn(IV)氧化物的接觸,從而降低了異化Mn(IV)還原菌的增殖速度,這一結(jié)果與各體系中Mn2+和TOC濃度變化相一致.

圖2 4種異化Mn(IV)還原菌在不同反應(yīng)體系中的豐度變化

C—時刻異化Mn(IV)還原菌豐度;0—初始時刻異化Mn(IV)還原菌豐度

2.2 異化Mn(IV)還原菌對有機藥物的去除效果

由異化Mn(IV)還原菌激活實驗可以看出,在兩種C源和電子受體的激活條件下,以葡萄糖為C源,δ-MnO2為電子受體實驗組激活效果最好.因此,試驗選取葡萄糖—δ-MnO2反應(yīng)體系沉積物為菌源,研究異化Mn(IV)還原菌對5種典型有機藥物的去除效果.在激活實驗中,葡萄糖—δ-MnO2反應(yīng)體系在第5d Mn2+的生成量基本趨于平衡,同時考慮到反應(yīng)時間過長,細菌自身代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會對微生物的生長造成不利影響,將有機藥物降解的時間定為5d.

2.2.1 有機藥物去除效果 圖3為無菌對照組、有機藥物為唯一碳源和外加葡萄糖3個反應(yīng)體系中Mn2+的濃度變化.從圖中可以看出異化Mn(IV)還原菌能夠以有機藥物為碳源進行代謝,并將δ-MnO2還原生成Mn2+.而加入葡萄糖可以增強細菌活性,促進錳的還原,這個過程可能會對有機藥物的去除產(chǎn)生影響.

圖4為不同條件下5種有機藥物的去除情況.無菌對照組、僅以有機藥物為碳源和外加C源三種情況下卡馬西平和布洛芬?guī)缀鯖]有去除,而萘普生的去除率分別為2.65%、5.74%和11.88%.由此可知,異化Mn(IV)還原菌對萘普生有一定的去除作用,而且添加了葡萄糖后能夠通過共代謝的作用提高其去除率.Wojcieszyńska等[38]在研究KB2對萘普生的去除時也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,當(dāng)外加葡萄糖時能夠?qū)⑤疗丈コ蕪?8%提高至78%.

圖3 Mn2+的生成量變化 Fig.3 Generation of Mn2+ in different experiments

相較于前三種有機藥物,異化Mn(IV)還原菌對雌二醇和雙氯芬酸的去除效果較好.無菌對照組、僅以有機藥物為碳源和外加C源三種情況下雌二醇的去除率分別為32.09%、75.70%、77.36%,雙氯芬酸的去除率分別為21.03%、58.25%、44.95%.由此可知,外加C源后對異化Mn(IV)還原菌去除雌二醇沒有顯著影響,而對雙氯芬酸的去除產(chǎn)生了一定的抑制作用.異化Mn(IV)還原菌的生物作用對雌二醇和雙氯芬酸貢獻的最大去除率分別為43.61%和37.22%(圖4f).楊夢麗[39]在研究異化金屬還原菌降解雙氯芬酸時也發(fā)現(xiàn)外加碳源會降低其降解率.產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是外加C源可以和雙氯芬酸競爭成為細菌的底物,導(dǎo)致其去除率有所下降.而外加C源對異化Mn(IV)還原菌去除不同有機藥物產(chǎn)生不同的影響效果可能與有機藥物自身特有的結(jié)構(gòu)相關(guān).

2.2.2 有機藥物去除動力學(xué) 對雌二醇和雙氯芬酸的去除進行一級和二級反應(yīng)動力學(xué)方程擬合,探究其去除動力學(xué)規(guī)律.無論是否添加外加C源,異化Mn(IV)還原菌體系中對雌二醇和雙氯芬酸的去除能較好的符合二級反應(yīng)動力學(xué)特征(2>0.9).

C為時刻有機藥物濃度(mg/L);0為初始時刻有機藥物濃度(mg/L)

表5 異化Mn(IV)還原菌去除雌二醇、雙氯芬酸的反應(yīng)動力學(xué)

3 結(jié)論

3.1 以葡萄糖作為C源,以δ-MnO2作為電子受體可以促進異化Mn(IV)還原菌的激活,實現(xiàn)發(fā)酵型異化Mn(IV)還原菌和呼吸型異化Mn(IV)還原菌的共同作用,加快Mn(IV)氧化物的還原.

3.2 異化Mn(IV)還原菌能以雌二醇和雙氯芬酸為唯一C源生長,分別實現(xiàn)75.70%和58.25%的去除,但外加C源會阻礙細菌對雙氯芬酸的降解.而異化Mn(IV)還原菌在無論是否外加C源時對卡馬西平和布洛芬?guī)缀鯖]有去除,但外加C源時可以通過共降解的作用實現(xiàn)萘普生11.88%的去除.

3.3 異化Mn(IV)還原菌對雌二醇和雙氯芬酸的去除符合二級反應(yīng)動力學(xué)特征.

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Activation of dissimilatory Mn(IV) reducing bacteria and their removal of typical pharmaceuticals.

ZHAI Jun1*, WANG Rong1, HUANG Ze-jin2, WANG Quan-feng1, LIU Wen-bo1,CHEN Yi-xuan1

(1.College of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China；2.China State Construction Engineering Corporation AECOM Consultants Co., Ltd Shaanxi Branch,Xi'an 710075, China).,2019,39(1)：298~305

In this study, sediment from JiaLing River was cultivated as inoculum of dissimilatory Mn(IV)-reducing bacteria. By using qPCR technique, this study investigated the effects of different carbon sources (glucose and Na-acetate) and different forms of manganese oxides (δ-MnO2and manganese ore powders) on activating dissimilatory Mn(IV)-reducing bacteria. Moreover, the most active dissimilatory Mn(IV) reducing bacteria was further tested the performance of removing 5 typical pharmaceuticals, namely carbamazepine, ibuprofen, naproxen, estradiol and diclofenac. Results demonstrated that glucose was the most suitable carbon sources while the δ-MnO2was the most suitable electron acceptor for the activation of dissimilatory Mn(IV)-reducing bacteria. The accumulated concentration of Mn2+reached 416.03mg/L after 10d cultivation, while the total consumption of TOC was 88.24%. After 5d cultivation, removal of carbamazepine and ibuprofen by the activated dissimilatory Mn(IV)-reducing bacteria was insufficient with or without additional carbon sources. Only 11.88% of naproxen was removed by the bacteria in the presence of additional carbon sources. However, the activated dissimilatory Mn(IV)-reducing bacteria could use estradiol and diclofenac as the sole carbon source, with removal efficiency of 75.70% and 58.25%, respectively.

dissimilatory Mn(IV) reduction；pharmaceuticals；biological removal；qPCR

X172

A

1000-6923(2019)01-0298-08

翟 俊(1977-),男,江蘇溧陽人,教授,博士,從事廢水處理理論與技術(shù)研究.發(fā)表論文50余篇.

2018-06-05

國家自然科學(xué)基金項目(512808533)

* 責(zé)任作者, 教授, zhaijun@cqu.edu.cn