王玉全，李程程，蘇路路，管博文，盧延華，孟愛民，樊飛躍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021)

FOXO3A又名橫紋肌肉瘤樣1叉頭框(forkhead rhabdomyosarcoma-like1,FKHRL1)，屬于叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)家族的O亞型，廣泛參與細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)， DNA損傷應(yīng)答以及抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)過程[1-4]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A在造血干細(xì)胞功能維持，造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用[4-7]。為了直接評(píng)價(jià)FOXO3A在造血系統(tǒng)損傷調(diào)節(jié)中的作用，探索相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供思路和方向，我們將FOXO3A基因敲除純合型小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物屏障環(huán)境飼養(yǎng)繁殖，成功繁育鑒定出FOXO3A基因敲除純合型小鼠。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)對(duì)野生型小鼠和純合型小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析，為以后開展造血系統(tǒng)損傷研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

FOXO3A基因敲除小鼠(FOXO3A+/-)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所張連峰課題組儲(chǔ)存(store number：016132-UCD)，雌性FVB/N小鼠4只，SPF級(jí)，體重16～18 g，5周齡；野生型雄性FVB/N小鼠2只，SPF級(jí)，體重16～18 g，5周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK (京) 2016-0011]。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK (京) 2015-0035]，按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程實(shí)行自由采食和飲水，墊料每周更換1次并補(bǔ)充飼料和飲用水。繁殖采用一雄一雌或一雄兩雌同籠合養(yǎng)方式進(jìn)行，雌鼠孕期為19～21 d，哺乳期為20～23 d，幼鼠在14日齡剪趾標(biāo)號(hào)，剪尾鑒定基因型，在21～24日齡分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案通過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)審批，IACUC號(hào)為：MAM17002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁育和實(shí)驗(yàn)過程中，在不影響實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

EasyPure Genomic DNA Kit購自Trans Gen Biotech公司，引物由上海賽默飛世爾科技公司合成，2×GC buffer、Recombinant Taq DNA Polymerase Taq購自TaKaRa公司，GelRedTM購自Bitotium公司，流式抗體CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均購自BD或 Bioscience公司；Bio-Rad T100 Thermal Cycler，Tanon-1600數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，BD FACSAria TMⅡ流式細(xì)胞儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠基因型鑒定

(1)小鼠基因組DNA的提取：小鼠剪趾標(biāo)號(hào)，剪尾0.5 cm置入1.5 mL無菌EP管中，參照Transgen的Genomic DNA Kit說明書提取基因組。

(2)引物設(shè)計(jì)：如表1。

(3)PCR反應(yīng)：根據(jù)Recombinant Taq DNA Polymerase Taq說明采用20 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中2× GC buffer 10 μL、dNTP(2.5 mmol/L each)1.6 μL、Forward Primer(50 μmol/L)0.2 μL、Reverse Primer(50 μmol/L)0.2 μL、rTaq polymerase 0.2 μL、DNA template 3 μL、H2O 4.8 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性，3 min；94℃變性，30 s；58℃退火，30 s；72℃延伸，30 s；72℃后延伸，10 min；35個(gè)循環(huán)。

(4)瓊脂糖凝膠電泳鑒定：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL在含GelRed (1×)的2%瓊脂糖凝膠中以120 V電壓電泳20 min后于凝膠成像儀中觀察。小鼠組織基因組瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為野生型(FOXO3A+/+，WT)：100 bp；純合型(FOXO3A-/-)：186 bp；雜合型(FOXO3A+/-)：100 bp、186 bp，基于此基因條帶可以鑒別每只小鼠基因型。

1.3.2 骨髓細(xì)胞檢測(cè)分析

為探討FOXO3A對(duì)造血系統(tǒng)的影響，進(jìn)行骨髓造血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分型檢測(cè)初步實(shí)驗(yàn)。

(1)骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)：取FOXO3A基因敲除純合型小鼠3只，雄性，體重25～31 g，11～16周齡；野生型3只作為對(duì)照，雄性，體重19～29 g，11～16周齡。小鼠脫頸處死，75%酒精浸泡消毒，無菌條件取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，用1 mL PBS緩沖液沖洗骨髓至2 mL EP管中，采用KOVA一次性計(jì)數(shù)板，人工骨髓計(jì)數(shù)。

(2)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例測(cè)定[8]：分離的骨髓細(xì)胞，每只小鼠取5×106個(gè)細(xì)胞，終體積100 μL。按體積比1:20加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體(CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b)，4℃孵育30 min，PBS洗滌一次，1500 r/min離心5 min，離心后去上清，100 μL PBS重懸，加入混合二抗抗體streptavidin(percp標(biāo)記)、scal-1(PE標(biāo)記)、ckit(APC標(biāo)記)，4℃孵育30 min，PBS洗滌一次，離心條件如上，200 μL PBS重懸。 BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)HPCs(Lin-c-kit+Sca1-or LSK- cells)，HSCs(Lin-c-kit+Sca1+or LSK+cells)在骨髓中所占的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠的繁殖情況

FOXO3A基因敲除雜合型雌鼠成功繁殖出子代幼鼠，雌鼠妊娠期為19～21 d，哺乳期為20～23 d，每胎產(chǎn)6～13只幼鼠，成活率在98%以上。

2.2 小鼠基因型鑒定

隨機(jī)選擇出生15 d 1～9號(hào)小鼠剪趾標(biāo)號(hào)，剪尾提取基因組，分別用引物FOXO3A-A、FOXO3A-B和引物FOXO3A-A、FOXO3A-C進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用水作為空白對(duì)照，野生型小鼠基因組作為陰性對(duì)照，雜合型小鼠基因組作陽性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果顯示陰性對(duì)照只擴(kuò)增得到100 bp條帶，為野生型小鼠；陽性對(duì)照擴(kuò)增得到100 bp和186 bp條帶，為雜合型小鼠；5、6號(hào)只擴(kuò)增得到186 bp條帶，為FOXO3A基因敲除純合型小鼠；2、3、8、9號(hào)為FOXO3A基因敲除雜合型小鼠，1、4、7號(hào)為野生型小鼠。(如圖1)

2.3 小鼠的生長(zhǎng)情況

幼鼠由雌鼠哺乳喂養(yǎng)，哺乳期為21 d左右，產(chǎn)后21～24 d離乳分籠。子代基因敲除純合型小鼠與雜合型小鼠長(zhǎng)勢(shì)正常，與野生型FVB/N小鼠相比外觀、生長(zhǎng)發(fā)育未見明顯差異。

2.4 FOXO3A基因敲除小鼠骨髓計(jì)數(shù)結(jié)果

小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO3A基因敲除純合型小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)與野生型小鼠相比[(6.167±1.424) vs. (10±1.732)]，未見明顯差異(P=0.1625)。結(jié)果表明，F(xiàn)OXO3A基因敲除不會(huì)引起小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)目的明顯改變。(如圖2)

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Protocol primers

圖3 FOXO3A基因敲除小鼠造血細(xì)胞表型分析Figure 3 Analysis of the phenotype of hematopoietic cells in FOXO3A knockout mice

注：A：1～9號(hào)小鼠用引物FOXO3A-A、FOXO3A-B擴(kuò)增結(jié)果；B：1～9號(hào)小鼠用引物FOXO3A-A、FOXO3A-C擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA marker，2000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照。圖1 子代小鼠基因型鑒定結(jié)果Note. A: Mice 1-9 were amplified with the primers FOXO3A-A and FOXO3A-B. B: Mice 1-9 were amplified with the primers FOXO3A-A and FOXO3A-C. M: DNA marker, 2000 bp; N: Negative control; P: Positive control.Figure 1 Genotype identification of daughter mice

圖2 FOXO3A基因敲除小鼠骨髓計(jì)數(shù)Figure 2 FOXO3A gene knockout mouse bone marrow cell counts

2.5 FOXO3A基因敲除小鼠造血細(xì)胞表型分析結(jié)果

為了直接觀察FOXO3A基因敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響，我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FOXO3A基因敲除純合型小鼠和野生型小鼠的骨髓細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析時(shí)門的設(shè)置如圖3所示。我們檢測(cè)了造血祖細(xì)胞(lin-scal-1-ckit+，HPC)，造血干細(xì)胞(lin-scal-1+ckit+，HSC)的比例和數(shù)目。結(jié)果如圖3所示，與野生型小鼠相比，F(xiàn)OXO3A基因敲除會(huì)引起骨髓中造血祖細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞數(shù)目卻沒有明顯改變(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO3A基因敲除未發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的明顯差異。

3 討論

FOXO3A作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，有“長(zhǎng)壽基因”之稱，廣泛表達(dá)于成人各種組織器官中。目前研究認(rèn)為FOXO3A參與多種疾病致病調(diào)節(jié)過程，例如腫瘤[9]、血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病[10]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11]等。先前研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的功能[12, 13]，F(xiàn)OXO3A基因缺陷小鼠隨年齡增長(zhǎng)或給予5-氟尿嘧啶(5-FU)刺激表現(xiàn)中性粒細(xì)胞增多，造血干細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)激活及增殖抑制蛋白Spred2(Sprouty-related Ena/VASP homology 1 domain-containing proteins 2)、p27Kip1表達(dá)下調(diào)，表明FOXO3A在造血干細(xì)胞功能維持及抗應(yīng)激調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。近來研究發(fā)現(xiàn)由Fancd2基因介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路與FOXO3A基因介導(dǎo)的應(yīng)激調(diào)節(jié)通路在造血干細(xì)胞維持上存在功能性互作[5]，這為應(yīng)激誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞衰竭等血液疾病治療開辟新的靶點(diǎn)。同時(shí)，衰老的造血干細(xì)胞中存在完整的FOXO3A介導(dǎo)的促自噬信號(hào)通路，保護(hù)其免受骨髓微環(huán)境中出現(xiàn)的能量危機(jī)、細(xì)胞因子匱乏等代謝應(yīng)激損傷[14]。衰老的造血干細(xì)胞易于積累DNA損傷，通常功能喪失，被認(rèn)為是提高老年人血液系統(tǒng)疾病發(fā)生率的根本原因之一[15]。由此，F(xiàn)OXO3A調(diào)節(jié)的促自噬機(jī)制是否通過保護(hù)損傷、功能缺陷的衰老造血干細(xì)胞而直接導(dǎo)致衰老相關(guān)血液系統(tǒng)疾病的發(fā)展也是我們值得關(guān)注的。

FOXO3A基因敲除動(dòng)物模型對(duì)直接評(píng)價(jià)FOXO3A功能、活性調(diào)控機(jī)制，了解FOXO3A在不同情況下的調(diào)節(jié)機(jī)制，為血液病等疾病的治療提供新思路是十分重要的。FVB/N品系小鼠受精卵有大而顯著的前核，易于進(jìn)行顯微注射，易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因模型構(gòu)建，同時(shí)，F(xiàn)VB/N小鼠繁殖力較強(qiáng)，子代數(shù)目多，采用FVB/N品系小鼠構(gòu)建基因缺陷動(dòng)物模型能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利開展提供模型保障。

將FVB背景的FOXO3A基因敲除雜合型小鼠嚴(yán)格按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)和繁育。雜合型小鼠與野生型交配，子代經(jīng)基因型鑒定后選育出雜合子，采用雜合子雌雄配對(duì)繁殖保種，可獲得FOXO3A基因敲除純合型小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。FOXO3A基因敲除雜合型雌鼠成功繁殖出子代幼鼠，雌鼠妊娠期為19～21 d，哺乳期為20～23 d，每胎產(chǎn)6～13只幼鼠，成活率在98%以上。幼鼠由雌鼠哺乳喂養(yǎng)，哺乳期為21 d左右，產(chǎn)后21～24 d離乳分籠。子代基因敲除純合型小鼠與雜合型小鼠長(zhǎng)勢(shì)正常，與野生型FVB/N小鼠相比外觀、生長(zhǎng)發(fā)育未見明顯差異。飼養(yǎng)繁育過程中，雌鼠會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間不孕或產(chǎn)子率低的情況，應(yīng)考慮互換雄鼠或替換掉年齡較大的雌鼠；若在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)噪音分貝高或驚嚇，會(huì)發(fā)生食子現(xiàn)象；偶爾也出現(xiàn)雌鼠懷孕或產(chǎn)仔后雄鼠死亡現(xiàn)象，建議平時(shí)多注意觀察照料。

基因型鑒定過程中，我們?cè)O(shè)計(jì)了三條引物，一條為通用引物，一條與通用引物來鑒定野生型，另外一條與通用引物來對(duì)鑒定FOXO3A基因敲除。通過兩對(duì)引物的擴(kuò)增情況來反映小鼠的基因型。同時(shí)，為了避免結(jié)果中出現(xiàn)的假陽性，增加鑒定的可靠性，我們?cè)O(shè)置水作為空白對(duì)照，野生型作陰性對(duì)照，雜合子或純合子作陽性對(duì)照。

為了評(píng)價(jià)FOXO3A基因敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響，我們分別對(duì)FOXO3A基因敲除小鼠和野生型對(duì)照小鼠進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，并采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)其造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的比例和數(shù)目。結(jié)果顯示，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，野生型小鼠和FOXO3A基因敲除小鼠相比，差異無顯著性。HSC比例和數(shù)目，兩組間沒有明顯的變化。FOXO3A基因敲除的HPC的比例較野生型有所增加，但是數(shù)目差異無顯著性。綜上，F(xiàn)OXO3A基因敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)表型沒有明顯的影響，初步測(cè)定結(jié)果可用于造血干細(xì)胞研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。我們后續(xù)也會(huì)開展一系列實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)FOXO3A基因敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及功能的影響。

(致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所張連峰教授、關(guān)菲菲老師、高翔老師給予的指導(dǎo)幫助。)