黃艷輝，馮 丹，丑 丹，劉 佳，祁 慧，劉雯雯，王 靜

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院婦科，武漢 430010)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)，簡稱內(nèi)異癥，是婦科領域中的多發(fā)病、疑難病，其進行性加重的盆腔粘連、疼痛和不孕對女性生理和心理造成了極大的負擔，傳統(tǒng)藥物治療手段效果欠佳、不良反應明顯，復發(fā)率高，嚴重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量，因此防治EMS一直是婦科領域的研究重點。

AKT/mTOR信號通路是被研究最多的細胞膜受體信號轉(zhuǎn)導通路之一，在促進細胞增殖、抗細胞凋亡、以及促進新血管生成方面發(fā)揮重要作用[1]。Li等[2]經(jīng)研究證實，激活的AKT通路可以上調(diào)增殖細胞核抗原、抗凋亡分子、生存素、粘附相關分子、整合素b1和整合素avb3的表達，促進異位內(nèi)膜細胞的增殖、粘附和侵襲。亦有研究發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路磷酸化，增強VEGF的表達，促進異位內(nèi)膜的浸潤和種植，推動EMS的發(fā)生和發(fā)展。[3-4]。

本課題組前期研究表明，溫經(jīng)止痛方治療EMS，取得較好臨床療，可明顯緩解患者痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛，改善生育能力，促進妊娠等[5]。本研究以AKT/mTOR通路為切入點，深入探討溫經(jīng)止痛方治療EMS的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性成熟未交配過的Wistar大鼠120只，體重200～250 g，鼠齡8～12周，均購于湖北省實驗動物研究中心[SCXK (鄂) 2015-0018]，無菌手術在武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學基地動物實驗室進行[SYXK (鄂) 2016-0056]，動物實驗經(jīng)由實驗動物管理委員會批準，審批號：L20170001，實驗動物使用按照3R原則給予人道的關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

實驗藥物：溫經(jīng)止痛方：當歸15 g、桂枝10 g、赤芍15 g、細辛3 g、炙甘草6 g、吳茱萸3 g、炮姜10 g、黃酒75 mL等組成，購自武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥房(天濟中藥飲片公司)，于我院制劑室煎煮濃縮，具體步驟如下：中藥生藥按上面處方比例調(diào)配總計21.59 kg，分為兩鍋，加水10倍，煎煮2次，第一次30 min，第二次20 min，合并濾液，加入黃酒7瓶，濃縮至8.5 L，加入防腐劑放入冰箱備用；孕三烯酮(每粒2.5 mg，北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

TRIzol，Invitrogen公司提供(15596018)；ReverTra Ace? qPCR RT Kit及SYBR? Green Real-time PCR Master Mix，購自Toyobo公司(561800，642800)；兔抗AKT、mTOR多克隆抗體濃縮液及Biotin-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit，購自武漢三鷹生物技術有限公司(20657-1-AP，10176-2-AP，SA00004-2)；ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(CSB-E08008r，CSB-E08005r)。

電泳儀購自北京六一儀器廠(DYY-6C)；定量PCR反應擴增儀購自ABI公司(7900HT)；紫外分光光度計購自上海析譜(UV-2202)；移液器購自法國Gilson公司；脫水機、包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立內(nèi)異癥動物模型

參考Jones手術移植改良方法建立模型[6]，120只雌性成熟Wistar大鼠，定時進行陰道涂片檢查，選擇動情期造模。手術在無菌條件下進行，麻醉大鼠后，將大鼠固定于手術板上，腹部剪毛，皮膚消毒后，在尿道上端約2 cm處，沿腹部中線切開約3 cm的切口，找到左側(cè)子宮，分離附著于子宮肌壁的脂肪和結(jié)締組織后，在離卵巢約l cm處剪取長2 cm子宮，斷端結(jié)扎。將所取子宮組織置于洛氏營養(yǎng)液中，剪取約0.5 cm × 0.5 cm大小3塊內(nèi)膜，分別縫于子宮分叉處、右卵巢附近，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。假手術組采用相同大小的大網(wǎng)膜脂肪作移植物，其余處理措施同上。建模4周后，擇動情期開腹，再次觀察移植物生長情況。造模成功的標志為：移植物體積增大，并形成內(nèi)有液體積聚、表面有血管攀生的透明小泡，同時取移植物送病檢證實內(nèi)膜成活，證明建模成功。

建模后每組選取2只觀察移植物生長情況；在建模及飼養(yǎng)過程中每組都有大鼠死亡，共有22只大鼠死亡。最后中藥中劑量組存活最少(15只)，故每組取15只檢測指標。

1.3.2 分組、給藥及處理

將建模成功的大鼠稱重后隨機分為5組，加正常對照組(假手術組)共6組，各15只。中藥高、中、低劑量組，分別給予7.4 g/mL、3.7 g/mL、1.85 g/mL的溫經(jīng)止痛方中藥，每日1 mL/100 g灌胃。西藥組：孕三烯酮膠囊0.05 mg/mL，每次1 mL/100 g灌胃，每周2次。模型組及正常組：每日生理鹽水1 mL/100 g灌胃。均給藥8周。

取材：各組大鼠分別于最后一次灌胃24 h后麻醉后腹主動脈取血，分離血清，-20℃保存待測，再用兩腳規(guī)測量移植物的體積：長(cm)×寬(cm)×高(cm)。取下在位子宮內(nèi)膜及子宮分叉處、右卵巢附近部位的移植病灶，-80℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.3.3 HE染色

組織固定切片脫蠟后，常規(guī)染色光鏡下進行組織病理學觀察。

1.3.4 實時定量PCR法檢測異位、在位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA的表達水平

熒光定量PCR采用TRIzol法提取RNA，將得到的RNA于BioTek ELx808酶標儀上行純度及濃度的測定，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)進行逆轉(zhuǎn)錄后于Roche定量儀器上，按免疫熒光定量試劑盒(Toyobo公司)進行定量，雙△Ct法計算相對表達量。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列均為5’→3’方向見表1。

1.3.5 免疫組化法檢測AKT、mTOR蛋白的表達

采用第二代免疫組化Elivision二步法檢測。一抗分別為兔抗AKT、mTOR多克隆抗體濃縮液，二抗為偶聯(lián)生物素的抗兔抗體(均購自武漢三鷹生物技術有限公司)。PBS代替一抗作陰性對照，AKT用已知的陽性表達的胰臟切片做陽性對照，mTOR用已知陽性表達的肝組織切片做陽性對照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 采用ELISA檢測大鼠血清各細胞因子

ELISA法檢測VEGF的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行。所有標本在一批內(nèi)測定，批內(nèi)誤差< 10%。

1.4 統(tǒng)計學方法

圖1 模型大鼠異位灶Figure 1 Ectopic focus of endometriosis in a model rat

2 實驗結(jié)果

2.1 EMS模型大鼠移植物的組織學形態(tài)

建模4周后，擇動情期開腹，觀察子宮內(nèi)膜異位種植生長情況，發(fā)現(xiàn)腹膜表面的移植物生長欠佳，卵巢表面及子宮分叉處移植物生長非常良好，移植物體積增大，并形成內(nèi)有液體積聚、表面有血管攀生的透明小泡，見圖1。HE染色結(jié)果顯示，EMS模型大鼠的異位內(nèi)膜組織與正常子宮內(nèi)膜的組織學形態(tài)基本相似，異位內(nèi)膜組織的內(nèi)膜下層變薄，腺體減少甚至消失，肌層變薄并出現(xiàn)纖維化，沒有明顯的外膜，僅有一些纖維組織包裹。見圖2。

2.2 免疫組化檢測AKT、mTOR在各組在位、異位內(nèi)膜上表達情況

AKT主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜中表達，mTOR主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)和細胞核中表達，如圖3～4。EMS模型組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜上AKT、mTOR的蛋白表達水平明顯高于正常對照組在位內(nèi)膜(P< 0.01)，見表2～3。

注：A：在位內(nèi)膜；B：異位內(nèi)膜。圖2 EMS模型大鼠在位和異位內(nèi)膜的組織學形態(tài)(HE染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium; B: Ectopic endometria.Figure 2 Histological features of eutopic and ectopic endometria in EMS model rats. HE staining

注：A：正常組在位內(nèi)膜；B：西藥組在位內(nèi)膜；C：中藥高劑量組在位內(nèi)膜；D：模型組異位內(nèi)膜；E：西藥組異位內(nèi)膜；F：中藥高劑量組異位內(nèi)膜。圖3 大鼠在位及異位內(nèi)膜AKT的表達情況(免疫組化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 3 Comparison of AKT protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

注：A：正常組在位內(nèi)膜；B：西藥組在位內(nèi)膜；C：中藥高劑量組在位內(nèi)膜；D：模型組異位內(nèi)膜；E：西藥組異位內(nèi)膜；F：中藥高劑量組異位內(nèi)膜。圖4 大鼠在位及異位內(nèi)膜上mTOR的表達情況(免疫組化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 4 Comparison of mTOR protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

表2 免疫組化檢測六組EMS模型大鼠異位、在位內(nèi)膜上AKT的表達比較(n=15)Table 2 Comparison of AKT expression in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，**P< 0.01；與模型組異位內(nèi)膜比較，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

表3 免疫組化檢測六組EMS模型大鼠異位、在位內(nèi)膜上mTOR的表達比較(n=15)Table 3 Comparison of mTOR expression in in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，**P< 0.01；與模型組異位內(nèi)膜比較，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

溫經(jīng)止痛方中藥低、中、高劑量組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR表達水平逐漸減弱，中藥中、高劑量組在位內(nèi)膜及中藥高劑量組異位內(nèi)膜上AKT、mTOR明顯低于模型組(P< 0.05)。西藥組在位內(nèi)膜上AKT亦明顯低于模型組(P< 0.05)。見表2～3。提示EMS模型組大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR表達水平升高，溫經(jīng)止痛方中藥可使EMS模型大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR蛋白表達水平下降，中藥高劑量組效果最佳。

2.3 Real-time PCR法檢測AKT、mTOR mRNA在各組大鼠在位、異位內(nèi)膜上表達情況

分別提取在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的總RNA及蛋白，用實時定量PCR法檢測AKT、mTOR mRNA的表達。模型組在位、異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA表達含量高于正常對照組在位內(nèi)膜，差異有顯著性(P< 0.01)，詳見表4。

中藥高、中劑量組異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA含量明顯低于模型組異位內(nèi)膜(P< 0.05)，中藥中劑量組異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA含量明顯低于西藥組異位內(nèi)膜(P< 0.05)。中藥高、中、低劑量組、西藥組在位內(nèi)膜AKT mRNA表達含量明顯低于模型組在位內(nèi)膜(P< 0.05)，其上mTOR mRNA表達含量亦低于模型組，但差異無顯著性(P> 0.05)，詳見表4。

以上數(shù)據(jù)說明EMS模型組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA表達含量升高，溫經(jīng)止痛方中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA表達水平下降。

2.4 溫經(jīng)止痛方對EMS模型大鼠血清中VEGF水平的影響

EMS模型組血清VEGF水平均高于正常對照組(P< 0.01)。溫陽化瘀法中藥高、低劑量組、西藥組血清VEGF水平明顯低于模型組(P< 0.01)；中藥中劑量組亦低于模型組(P< 0.05)。中藥高劑量組血清VEGF水平低于中藥中、低劑量組，但差異無顯著性(P> 0.05)，詳見表5。

以上結(jié)果提示EMS模型大鼠血清VEGF水平表達升高，溫陽化瘀法中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并隨中藥濃度升高，其對VEGF分泌的抑制作用增強。

表4 RT-PCR法檢測AKT、mTOR mRNA的在各組內(nèi)膜上表達情況Table 4 Expression of AKT and mTOR mRNAs in the endometria of each group determined by RT-PCR

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，*P< 0.05；與模型組異位內(nèi)膜比較，#P< 0.05；與西藥組異位內(nèi)膜比較，▲P< 0.05。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,*P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the model group,#P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the Nemestran group,▲P< 0.05.

表5 六組EMS模型大鼠血清VEGF水平的比較Table 5 Comparison of serum VEGF levels in the six groups of EMS model rats

注：與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

隨著研究日漸深入，證實AKT/mTOR信號通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展過程，在EMS中存在該信號通路的過度激活，并通過調(diào)節(jié)細胞自噬、凋亡因子等的表達，影響異位內(nèi)膜的粘附、侵襲、血管生成及增殖凋亡等過程[7]。

近年研究發(fā)現(xiàn)AKT能夠磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，其產(chǎn)物NO可以促進血管生成，并發(fā)現(xiàn)EMS患者體內(nèi)eNOS表達明顯升高[8]，異位病灶周圍血管生成增多,可能都與AKT通路的激活有關[9-10]。Chang等[11]報道，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(NME1)的異常低表達，可激活AKT通路，進而分泌大量IL-8和VEGF，促進異位病灶處血管內(nèi)皮細胞的大量生成。Govatati等[12]研究發(fā)現(xiàn)EMS在位內(nèi)膜中PTEN基因的缺失，使AKT通路過度激活，活化的AKT能夠抑制Bad活性，產(chǎn)生抑制凋亡作用，Bad屬于Bcl-2家族一員，具有促凋亡作用。

Cinar等[13]亦證實：EMS的女性在位內(nèi)膜AKT信號傳導通路磷酸化水平高于無EMS的女性。Annu等[14]實驗證實：EMS中異位灶的粘附與生長過程涉及多條信號通路的相互作用及協(xié)調(diào)，其中AKT信號傳導通路發(fā)揮了重要作用。

mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長中處于核心地位，其最主要的功能是調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯過程。Leconte等[15]研究發(fā)現(xiàn)，深部浸潤型EMS患者在位和異位內(nèi)膜細胞的增殖率均明顯升高,認為異位內(nèi)膜細胞的過度增殖和mTOR/AKT通路的激活有關，而mTOR/AKT抑制劑能有效抑制異位內(nèi)膜細胞的增殖。

Feng等[16]腹腔鏡下觀察子宮內(nèi)膜異位病灶的特點為病灶周圍存在大量腹膜血管，組織學檢查子宮內(nèi)膜異位病灶的特點為高度的血管化。因此，新生血管在EMS形成的過程中起著重要的作用。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最為關鍵的血管形成因子，可與血管內(nèi)皮表面的特異性受體結(jié)合，促進血管的形成[17]。Kianpour等[18]研究發(fā)現(xiàn)EMS患者腹腔液及病灶中VEGF水平較正常對照組明顯升高，提示異位子宮內(nèi)膜病灶中VEGF的過度表達，可以增強血管的生成能力。

本課題通過動物實驗，采用免疫組化及PCR檢測，證實EMS模型組大鼠在位、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白水平升高，顯著高于正?？瞻讓φ战M(P< 0.05)，與文獻報道相符[7-12, 19]，提示AKT、mTOR異常表達與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展有關。EMS模型大鼠血清VEGF水平表達升高，提示與異位病灶的血管生成有關。而異位內(nèi)膜PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路磷酸化，增強VEGF的表達，導致異位內(nèi)膜侵襲、種植、生長，共同促進了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展。以上研究表明AKT/mTOR信號通路中的AKT、mTOR做為關鍵性的調(diào)控因子，可能在內(nèi)異癥的發(fā)病過程中起到“閘門”的作用。

同時實驗研究表明：溫經(jīng)止痛方可降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白相對表達量，抑制AKT/mTOR信號通路，溫陽化瘀法中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并隨中藥濃度升高，其對VEGF分泌的抑制作用增強，呈劑量依賴性。本方可影響異位內(nèi)膜的粘附、侵襲，血管生成及增殖凋亡等過程；使在位子宮內(nèi)膜、異位子宮內(nèi)膜及腹腔局部微環(huán)境發(fā)生改變，抑制異位內(nèi)膜生長；從而達到治療EMS目的。如能進一步研究其通路確切機制及上下游相關因子，可促進研發(fā)靶向作用更強、臨床療效更好的中西藥。