康 婷，陳 波，歐三桃*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000)

心血管事件是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者的首要死亡原因，血管鈣化是心血管事件的基本病變。近年來認(rèn)為CKD中的血管鈣化不再僅僅是血清鈣磷水平上升后沉積在血管壁的被動(dòng)過程，而是一個(gè)平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的主動(dòng)過程。既往研究表明，系統(tǒng)性及局部炎癥在CKD血管鈣化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，CKD患者不僅可以出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥因子如CRP、IL-6的表達(dá)升高，在冠狀動(dòng)脈鈣化斑塊中也發(fā)現(xiàn)局部促炎系統(tǒng)及促成骨分化的分子表達(dá)增加如CD40、CD154、SATB2、galectin-3以及巨噬細(xì)胞等[1]。此外，Benz等[2]認(rèn)為鈣化血管的局部微炎癥不依賴于血清鈣磷水平的變化，有研究發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的成骨細(xì)胞樣分化起著重要作用，尤其可以通過影響Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的表達(dá)從而調(diào)節(jié)血管鈣化[3]，但目前大多數(shù)研究只是針對(duì)單一炎癥因子的檢測(cè)及研究。近年來血清炎癥因子抗體芯片的問世可以實(shí)現(xiàn)同步、高通量地檢測(cè)血清中多項(xiàng)炎癥因子水平的變化。常用來誘導(dǎo)大鼠慢性腎臟病血管鈣化方法主要有單純腺嘌呤、維生素D3聯(lián)合尼古丁或華法林、5/6腎切除等，但往往存在耗時(shí)久，成本高，成模率低，死亡率高的風(fēng)險(xiǎn)，阿霉素腎病模型是經(jīng)典的模擬人類腎小球疾病模型之一[4]。因此本研究擬通過聯(lián)合腺嘌呤灌胃和阿霉素尾靜脈注射造慢性腎臟病血管鈣化模型,采用血清細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)，觀察和檢測(cè)CKD血管鈣化大鼠血清中多種炎癥細(xì)胞因子水平的變化，并探討這些細(xì)胞因子與血管鈣化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡SD雄性大鼠30只，體重250～280 g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)城北校區(qū)動(dòng)物中心[SCXK (川) 2013-17]，于西南醫(yī)科大學(xué)城北校區(qū)動(dòng)物房飼養(yǎng)并取材[SYXK (川) 2013-065]，相對(duì)濕度70%，環(huán)境溫度(24 ± 2)℃，光照12 h/12 h明暗交替，每籠5只飼養(yǎng)，并按照3R原則給以人道的關(guān)懷。福利倫理審查證號(hào)：20180306114。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(貨號(hào)V900471，批號(hào)XWBC5614 V，規(guī)格100 g，Sigma)；阿霉素(規(guī)格10 mg，海正輝瑞制藥有限公司)；α-SMA抗體(貨號(hào)BS70000，批號(hào)AAD44161，規(guī)格50 μL，Bioworld)；Runx2抗體(貨號(hào)sc-101145，批號(hào)A2918，規(guī)格50 μL，Santa Cruz)；免疫組化試劑盒(貨號(hào)SP-0023，批號(hào)AH03014880；及貨號(hào)SP-0024，批號(hào)AG08074831，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Raybiotech試劑盒(上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司提供)；GSR-CYT-3-1芯片(Raybiotech，美國(guó))。自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman)；石蠟切片機(jī)(Finesse ME+，Thermo)；倒置相差顯微鏡(Nikon)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及建模

30只SD雄性大鼠，適應(yīng)環(huán)境1周后給藥。按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：對(duì)照組(n=15)和模型組(n=15)。模型組：按照每只大鼠3.0 mg/kg的劑量尾靜脈注射阿霉素，僅在造模第1天給予阿霉素，同時(shí)按照150 mg/(kg·d)的劑量灌胃腺嘌呤混懸液，持續(xù)28 d。對(duì)照組僅給予同等相應(yīng)體積的生理鹽水尾靜脈注射及灌胃，持續(xù)28 d。

1.3.2 組織取材與血液、尿液留取

在造模第29天取材，用生理鹽水配成1%戊巴比妥鈉，按照40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔后下腔靜脈取血，以3500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心10 min后取血清，每管500 μL分裝后，部分血清用于測(cè)定腎功及電解質(zhì)；部分用于做抗體芯片，剩余血清-80℃冰箱凍存。取雙腎，迅速置于預(yù)冷的PBS中，剝除腎筋膜后，一部分置于4%的多聚甲醛中，做常規(guī)石蠟包埋、切片，供病理和免疫組化檢查，另一部份置于-80℃冰箱中備用。沿著心臟動(dòng)脈弓向下逐漸游離胸腹主動(dòng)脈，部分用于石蠟包埋切片，部分凍存于-80℃冰箱。

1.3.3 大鼠腎功、血鈣及血磷的檢測(cè)

采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血鈣及血磷。

1.3.4 HE染色

常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木素染5 min后水洗，1%鹽酸酒精分色2 s后水洗，0.5%氨水返藍(lán)1 min后水洗，75%乙醇2 s，1%伊紅30 s后水洗，脫水透明封片。

1.3.5 von Kossa染色

常規(guī)脫蠟水化，1%硝酸銀溶液處理，紫外線照射20 min，蒸餾水洗1 min，5%硫代硫酸鈉溶液處理2 min，核固紅復(fù)染5 min，常規(guī)脫水，透明，封片。黑色染色為陽性。

1.3.6 免疫組化檢測(cè)α-SMA及Runx2表達(dá)及分布

60℃孵箱烤片，常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，抗原修復(fù)，蒸餾水浸泡5 min，3% H2O2去離子水孵育15 min，正常山羊血清室溫封閉20 min。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3 min × 3次。滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS洗3 min × 3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS洗3 min × 3次，新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，棕黃色或棕褐色為陽性表達(dá)。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染20 s，脫水，透明，封片。

1.3.7 天狼星紅染色

常規(guī)脫蠟復(fù)水，天狼猩紅染液滴染2 h，水洗，蘇木素染核5 min，水洗，脫水透明封片。

1.3.8 抗體芯片檢測(cè)

根據(jù)Raybiotech試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行芯片檢測(cè)，共檢測(cè)27種細(xì)胞因子，芯片上每種抗體設(shè)置4次技術(shù)重復(fù)。對(duì)掃描獲取的芯片圖像，使用GenePix Pro 6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)，包括熒光信號(hào)、背景等，數(shù)據(jù)分析時(shí)首先計(jì)算4次重復(fù)的均值，以此作為每種因子的信號(hào)值，然后以陽性參照進(jìn)行樣本間信號(hào)值的歸一化，最后使用歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行濃度定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎功及血鈣、血磷指標(biāo)變化

模型組大鼠BUN、SCr、血鈣、血磷均高于對(duì)照組，且差異均有顯著性(P< 0.05；表1)。

表1 兩組大鼠血生化指標(biāo)Table 1 Blood biochemical indexes of the two groups

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 大鼠主動(dòng)脈鈣化情況

肉眼觀察，可見對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈光滑、柔軟，富有彈性；模型組大鼠主動(dòng)脈可見明顯的白色鈣化結(jié)節(jié)，呈現(xiàn)出軟骨狀，血管壁僵硬(圖1)。HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組血管分層明顯，彈性纖維連續(xù)，血管壁完整；模型組血管中膜層有明顯的彈性纖維斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，血管壁完整性破壞。von Kossa染色結(jié)果顯示：對(duì)照組血管無黑色染色，模型組血管中膜層可見明顯廣泛、連續(xù)分布的黑色顆粒沉積，血管壁外膜層及內(nèi)膜層未見黑色顆粒沉積，界限分明，即表明血管中膜層大量鈣化結(jié)節(jié)形成，同時(shí)伴有明顯的彈性纖維斷裂，血管壁完整性破壞(圖2)。

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖1 兩組大鼠主動(dòng)脈大體形態(tài)比較Note. A: Control group; B: Model group.Figure 1 Comparison of gross morphology of the in aortas two groups

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖2 兩組大鼠主動(dòng)脈鈣化情況比較(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 2 Comparison of aortic calcification in the two groups

2.3 大鼠主動(dòng)脈成骨樣分化形成

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈上大量表達(dá)α-SMA，呈現(xiàn)廣泛均勻分布的棕黃色顆粒，模型組大鼠主動(dòng)脈上α-SMA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，顏色變淡；與之相反Runx2在模型組大鼠主動(dòng)脈壁中膜層表達(dá)較多，呈現(xiàn)明顯分布的棕黃色顆粒，而對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁幾乎無表達(dá)(圖3)。

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖3 兩組大鼠主動(dòng)脈免疫組化染色(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 3 Immunohistochemical staining of the aorta in two groups

2.4 大鼠腎病理改變

天狼猩紅染色結(jié)果顯示：對(duì)照組腎小球及腎間質(zhì)未見明顯紅色染色，腎小管排列緊密，分布均勻；模型組腎間質(zhì)及腎小球球囊壁周膠原纖維增加，纖維化十分明顯(紅色部分)，腎小球及腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞部分壞死伴管腔內(nèi)有棕褐色的針狀尿酸鹽結(jié)晶沉積(圖4)。

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖4 兩組大鼠腎病理比較(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 4 Comparison of the pathological changes in renal tissues of the two groups

2.5 血清抗體芯片分析結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組血清中27種細(xì)胞因子水平表達(dá)的熒光信號(hào)發(fā)生顯著變化(表2，圖5)。濃度定量分析顯示：與對(duì)照組相比，慢性腎臟病血管鈣化大鼠的血清中炎性因子失衡，促炎因子較抗炎因子明顯增加，其中大部分促炎因子如細(xì)胞因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子(cytokine induced neutrophils chemical chemokines，CINC)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1抑制劑(matrix metalloproteinase-1 inhibitor，TIMP-1)、L-選擇素(L-selectin)及三個(gè)抗炎因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)表達(dá)顯著上調(diào)，而抗炎因子如白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)和促炎因子如趨化因子(fractaikine)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)有所下降(圖6，圖7)。

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖5 血清抗體芯片掃描結(jié)果Note. A: Control group; B: Model group.Figure 5 Serum antibody chip scanning results

表2 GSR-CYT-3-1芯片陣列圖Table 2 GSR-CYT-3-1 chip array map

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖6 模型組較對(duì)照組表達(dá)上升的細(xì)胞因子Note. A: Control group; B: Model group.Figure 6 Increased cytokine expressions in the model group compared with the control group

注：A：對(duì)照組；B：模型組。圖7 模型組較對(duì)照組表達(dá)下降的細(xì)胞因子Note. A: Control group; B: Model group.Figure 7 Reduced cytokine expressions in the model group compared with the control group

3 討論

慢性腎臟病(CKD)患者并發(fā)血管鈣化不僅導(dǎo)致腎功能進(jìn)一步減退，還會(huì)減少血管順應(yīng)性、影響冠狀動(dòng)脈灌注、損害左心室舒張功能。流行病學(xué)研究表明80%的CKD 5期患者存在冠狀動(dòng)脈鈣化，50%的患者冠狀動(dòng)脈鈣化積分(Agaston評(píng)分)> 400，提示高風(fēng)險(xiǎn)心血管事件[5]。對(duì)未透析的3～5期CKD患者的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化和嚴(yán)重血管鈣化的發(fā)生率分別高達(dá)79%和47%[6]。CKD患者并發(fā)血管鈣化機(jī)制非常復(fù)雜，而反映早期血管鈣化的血清學(xué)指標(biāo)及治療方法的局限等共同增加了血管鈣化的風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者認(rèn)為炎癥可能通過直接或間接的方式參與血管鈣化的形成與發(fā)展，但僅僅檢測(cè)了單一或少量的炎性因子，且具體機(jī)制尚不明確。

本研究通過給予大鼠150 mg/(kg·d)腺嘌呤混懸液連續(xù)灌胃28 d聯(lián)合首次尾靜脈注射3.0 mg/kg阿霉素，從而造成免疫、代謝復(fù)合致病因素所致的腎小球、腎小管復(fù)合損傷的慢性腎臟病并發(fā)血管鈣化的動(dòng)物模型，與人類慢性腎臟病的臨床表現(xiàn)及病理過程相似。血清學(xué)指標(biāo)顯示模型組大鼠有明顯的血肌酐及尿素氮升高(P< 0.01)，同時(shí)伴有高磷血癥(P< 0.01)及高鈣血癥(P< 0.05)，腎天狼猩紅染色顯示模型組大鼠腎間質(zhì)及腎小球球囊壁有顯著的腎纖維化病變，以上結(jié)果均表明與對(duì)照組比較，模型組大鼠已出現(xiàn)嚴(yán)重的慢性腎損害。血管von Kossa染色結(jié)果顯示模型組血管壁中膜彈力層較正常組有明顯的線性沉積的鈣結(jié)節(jié)形成，與既往研究認(rèn)為CKD主要發(fā)生中膜鈣化相一致[7]。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與血管鈣化形成緊密相關(guān)，目前在正常人群、CKD患者、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及體外實(shí)驗(yàn)都得到了驗(yàn)證[8]。本研究的血管免疫組化結(jié)果也顯示模型組較對(duì)照組大鼠血管壁中膜層鈣化特異標(biāo)志物Runx2表達(dá)明顯增加，而血管平滑肌細(xì)胞特異標(biāo)志物α-SMA表達(dá)下降，表明在血管鈣化的過程中血管平滑肌細(xì)胞已發(fā)生成骨樣細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，提示慢性腎臟病血管鈣化大鼠模型建立成功。

細(xì)胞因子是炎癥疾病重要的調(diào)節(jié)劑，近年來研究表明炎癥對(duì)血管鈣化的致病機(jī)制起著重要作用，多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6是血管鈣化的關(guān)鍵刺激因素[9]。細(xì)胞因子抗體芯片是一項(xiàng)快速發(fā)展的新技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞因子，研究疾病相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)譜，具有高通量、高特異性、高靈敏度、樣品消耗少的特點(diǎn)[10]。因此本研究利用抗體芯片技術(shù)觀察CKD并發(fā)血管鈣化大鼠血清中炎性因子水平表達(dá)差異，更加全面地了解炎性因子與血管鈣化的相關(guān)性。芯片分析結(jié)果顯示，模型組的大鼠血清中大部分細(xì)胞因子表達(dá)增加，其中促炎因子CINC、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TIMP-1、L-selectin及部分抗炎因子GM-CSF、IL-2、IL-10較對(duì)照組均有不同程度的升高，抗炎因子IL-4、IL-13及促炎因子fractaikine、IL-1β、TNF-α較對(duì)照組降低。促炎因子的大量增加說明血管鈣化過程中發(fā)生了炎癥反應(yīng)，而重要的抗炎因子IL-2、IL-10的顯著上升說明炎癥反應(yīng)啟動(dòng)了抗炎機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子fractaikine、IL-1β、TNF-α降低，抗炎因子和促炎因子的相互對(duì)抗使平衡被打破，致炎因子起到主導(dǎo)作用，抗炎因子作用被削弱，引發(fā)血管鈣化。慢性炎癥是異常軟組織鈣化的中心因素，通常認(rèn)為血管慢性炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化鈣化相關(guān)[11]。動(dòng)脈粥樣硬化鈣化主要發(fā)生在內(nèi)膜層，而本研究觀察到CKD并血管鈣化主要發(fā)生在中膜層，提示炎癥可能還與中膜鈣化相關(guān)。Agharazii等[12]在CKD并發(fā)血管鈣化大鼠模型中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化同時(shí)，血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)也明顯增加。而本研究模型組IL-6上升，IL-1β和TNF-α降低，除了抗炎因子的抑制作用，可能也與血管鈣化的時(shí)間段有關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。MCP-1是一種單核細(xì)胞趨化因子，多項(xiàng)研究表明，血管鈣化伴隨有血清MCP-1水平增加以及鈣化血管組織MCP-1受體上調(diào)，MCP-1還可影響Runx2的表達(dá)，促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生[13 - 15]，本研究也發(fā)現(xiàn)模型組較對(duì)照組血清中MCP-1明顯增多，說明MCP-1作為一種促鈣化因子主要與血管平滑肌細(xì)胞表型變化相關(guān)。最新研究也發(fā)現(xiàn)臨床終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)患者血清C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平增高組與對(duì)照組相比，動(dòng)脈血管中TNF-α和MCP-1表達(dá)增加，即表明系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)與局部血管炎癥相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)炎癥可以通過激活mTORC1通路誘導(dǎo)血管收縮表型向成骨表型轉(zhuǎn)化從而加劇血管鈣化的進(jìn)程[16]。Willy等[17]發(fā)現(xiàn)臨床CKD血液透析患者可以通過改善透析膜增強(qiáng)透析，清除血清中分子的促炎因子如IL-6、TNF-α等從而減輕血管鈣化；類似地，通過選擇性藥物抑制透析患者血清中的IL-1、TNF-α、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)可以防止間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換并顯著降低鈣沉積[18]，因此減少血清中促炎因子水平可能會(huì)限制血管鈣化的進(jìn)展，本研究只檢測(cè)了CKD血管鈣化模型中血清炎癥因子的水平變化，還需采取干預(yù)系統(tǒng)性炎癥的措施以進(jìn)一步探索防治血管鈣化的新方法。

綜上所述，通過腺嘌呤聯(lián)合阿霉素可以快速、成功地制造慢性腎臟病并血管鈣化的動(dòng)物模型。血清抗體芯片分析發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病血管鈣化大鼠存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，可能與Runx2的激活有關(guān)，促進(jìn)了血管鈣化的形成，但還需進(jìn)一步通過血管的局部炎癥反應(yīng)及炎癥因子受體的檢測(cè)明確其相關(guān)性。炎癥反應(yīng)的激活也提示我們對(duì)血管鈣化的檢測(cè)傾向于增強(qiáng)或不僅僅局限于傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，控制炎癥反應(yīng)有助于慢性腎臟病血管鈣化的防治。