李玉梅，鮑慧瑋，王楚盈*，張亞杰，韓 冬，潘建衡，方 晶，黃金秋，劉仲康

(1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院麥克德爾米德實驗室，長春 130012)

近年來，提出血管新生的概念，血管新生是機體正常發(fā)育和組織修復(fù)的基礎(chǔ)，是一系列復(fù)雜的生物學(xué)行為。缺血性心臟病、糖尿病所致的傷口不易愈合等，其根本原因均與血管新生功能不良有關(guān)[1-2]。治療性血管新生則是使機體在缺血或缺氧等狀態(tài)下，通過修復(fù)以及重塑或是促進新生血管，改善缺血缺氧等病理狀態(tài)。而在治療性血管新生過程中，最關(guān)鍵環(huán)節(jié)則是內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化。

中醫(yī)藥在治療性血管新生方面歷史悠久，中醫(yī)認為祛瘀血可以生新絡(luò)，益氣、活血、化瘀等藥物均對血管新生具有一定療效，如黃芪為傳統(tǒng)的補氣藥，黃芪中的黃芪甲苷可以促進缺氧內(nèi)皮細胞的增殖，有利于血管生成[3-4]。當(dāng)歸為補血藥，當(dāng)歸中的阿魏酸則具有抑制血小板聚集，輔助建立側(cè)枝循環(huán)，改善缺血區(qū)供血，促進血管再生。然而二成分合用如何促進新生血管，機制尚不完全明確，因此本實驗采用氯化鈷建立HUVECs缺氧損傷模型，探索黃芪甲苷與阿魏酸合用對血管生成影響的潛在機制，為臨床治療與血管新生相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)(上海澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

阿魏酸(純度> 98%，批號：GR-134-170925，南京廣潤生物制品有限公司)；黃芪甲苷(純度> 98%，批號：150202，成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司)；HUVECs完全培養(yǎng)液(批號：170521，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)；HUVECs基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號：170525，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(批號：42H10121，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CCK-8(上海翊圣生物科技有限公司)；BD MatrigelTMBasement Membrane Matirx基質(zhì)膜(批號：7345017，Corning Incorporated)；AG490(批號：X15A7Y19393，上海源葉生物科技有限公司)。SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；YLD-6000恒溫震蕩培養(yǎng)箱(江蘇金壇市億通電子有限公司)；XI5300熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)；TDL-80-2B低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；WD-9405B水平搖床(北京六一)；DYY-7C電泳儀(北京六一)；DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽(北京六一)；DYCZ-24DN北京雙垂直蛋白電泳儀(北京六一)；WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)。

1.3 實驗方法

1.3.1 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及給藥處理

HUVECs接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液各給藥組進行如下操作：①正常對照組：給予等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；②模型對照組：給予氯化鈷250 μmol/L；③黃芪甲苷組，給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷及50 μmol/L的黃芪甲苷；④阿魏酸組，給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷及100 μmol/L的阿魏酸；⑤黃芪甲苷+阿魏酸合用組：給予終濃度為250 μmol/L氯化鈷、50 μmol/L的黃芪甲苷及100 μmol/L的阿魏酸。⑥AG490組：給予100 μmol/L AG490；⑦黃芪甲苷+阿魏酸組+ AG490組：給予終濃度為100 μmol/L AG490、50 μmol/L的黃芪甲苷及100 μmol/L的阿魏酸，上述各組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 內(nèi)皮細胞增殖檢測

藥物干預(yù)結(jié)束后采用CCK-8法檢測各組細胞活力，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔中重新加入100 μL內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，采用酶標(biāo)儀，檢測波長為450 nm測定各組細胞吸光度值。采用死活細胞染色技術(shù)，觀察死活細胞情況，將鈣黃素及碘化丙啶(PI)染色液加依次加到細胞孔中，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置5 min。吸棄染色液，在熒光倒置顯微鏡下觀察，活細胞為綠色，死細胞為紅色，拍照記錄。

細胞存活率(%)=各組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

1.3.3 熒光染色觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)

HUVECs按1.3.1方法處理后使用4%多聚甲醛溶液進行細胞固定，每孔加入100 μL羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(TRITC phalloidin)工作液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3次，100 μL DAPI溶液對細胞核進行染色，約30 s，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.3.4 細胞遷移實驗

接種細胞前先用標(biāo)記筆在24孔板各孔底部劃井字線，調(diào)整細胞濃度并接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，待細胞鋪滿整個培養(yǎng)孔底部，吸棄培養(yǎng)液，用1 mL移液槍頭沿中軸劃一道劃痕，用PBS清洗細胞表面2次除去漂浮的細胞，同時進行劃痕部位拍攝，拍攝后按1.3.1方法給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在同一位置再次拍照，用Image J圖像處理軟件測量遷移距離，與自身劃痕距離作對比，計算遷移率，判斷細胞的生長運動能力。

1.3.5 內(nèi)皮細胞體外成管實驗[5]

基質(zhì)膠至于4℃冰箱，冰浴過夜進行解凍。將基質(zhì)膠鋪于96孔板中每孔50 μL，放置于培養(yǎng)箱30 min使其凝固。將細胞用含藥培養(yǎng)基配置成細胞懸液，接種于基質(zhì)膠上，每孔50 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，于倒置顯微鏡下觀察微管形成情況，選取6個不同視野，記錄平均節(jié)點數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達

將HUVECs調(diào)整濃度至每孔1 × 105個，置于6孔板中，按照1.3.1中方法進行處理，給藥培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液，冰上靜置5 min，低溫冷凍離心，12 000 r/min 4℃離心10 min。分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物，用5× loading buffer和PBS稀釋蛋白樣品，于沸水浴中煮沸5 min。行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，用TBST緩沖液配制5%(質(zhì)量/體積)脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗分別為p-JAK2抗體、p-STAT3抗體，孵育二抗為羊抗兔IgG，TBST漂洗后進行ECL底物發(fā)光。將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 黃芪甲苷與阿魏酸合用對氯化鈷損傷的HUVECs增殖的影響結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過氯化鈷處理后的HUVECs的存活率(模型組)明顯低于對照組(P< 0.05)。阿魏酸、黃芪甲苷干預(yù)后細胞存活率有所增加。二藥合用與單獨給藥相比，細胞存活率顯著增加(P< 0.001)。給予AG490通路抑制劑后，明顯抑制細胞增殖，給予阿魏酸、黃芪甲苷兩藥后，與AG490組比較，細胞明顯增多。兩藥合用具有明顯的拮抗AG490對內(nèi)皮細胞的抑制作用(表1)。死活細胞染色結(jié)果與酶標(biāo)儀檢測結(jié)果一致(圖1)。

表1 藥物對HUVECs細胞活力的影響Table 1 Effects of drugs on the viability of HUVECs

注：與對照組比較，▲P< 0.05；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。
Note. Compared with the control group, ▲P< 0.05. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。紅色為死細胞；綠色為活細胞。圖1 死活細胞染色結(jié)果(× 100)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Red indicates dead cells; Green indicates living cells.Figure 1 Staining results of living and dead cells

2.2 阿魏酸與黃芪甲苷合用對缺氧損傷HUVECs形態(tài)的影響結(jié)果

由熒光染色結(jié)果顯示(圖2)，氯化鈷刺激后，對細胞造成損傷，細胞狹長，出現(xiàn)皺縮，骨架縮小等，有些細胞甚至未見明顯的細胞骨架(見模型組)。對照組細胞貼壁良好。給予黃芪甲苷、阿魏酸之后，細胞形態(tài)有所改善，細胞扁平，成多角形，有偽足，纖維蛋白絲清晰可見。給予AG490后，細胞也出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細胞數(shù)與對照組比較明顯減少，給予黃芪甲苷及阿魏酸后，細胞形態(tài)和數(shù)量均有所改善。黃芪甲苷與阿魏酸具有促進細胞增殖，改善細胞形態(tài)的作用，聯(lián)合使用，效果更佳。

2.3 阿魏酸與黃芪甲苷合用對缺氧損傷HUVECs遷移能力的作用結(jié)果

與自身劃痕距離做對比進行計算遷移率，結(jié)果顯示，對照組細胞遷移率為49.52%，模型組由于氯化鈷造成缺氧損傷，細胞的遷移能力下降，細胞修復(fù)至中央劃痕區(qū)的遷移率僅為12.98%。經(jīng)黃芪甲苷及阿魏酸干預(yù)后，細胞的劃痕修復(fù)距離有所增加，黃芪甲苷、阿魏酸、黃芪甲苷+阿魏酸合用組均為100%，劃痕區(qū)域均長滿細胞。給予AG490后，細胞遷移距離為13.45%，同時給予黃芪甲苷和阿魏酸，間隙縮小，遷移距離為52.12%。黃芪甲苷與阿魏可促進缺氧HUVECs的遷移運動(結(jié)果見表2，圖3)。

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。紅色為纖維蛋白絲；藍色為細胞核。圖2 各給藥組對HUVEC細胞形態(tài)的影響(× 100)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Red indicates fibrin filament; Blue indicates nucleus.Figure 2 Protective effect of the drugs on endothelial cells in each group

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。標(biāo)尺=50 μm。圖3 藥物對HUVEC細胞遷移測定的影響(× 40)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV.Bars=50 μm.Figure 3 Effects of the drugs on HUVEC migration

2.4 阿魏酸與黃芪甲苷合用體外成管作用的結(jié)果

如圖4所示，所有組的HUVECs在24 h后形成了毛細血管狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與對照組相比，黃芪甲苷、阿魏酸以及兩藥合用成管能力均有所增加，尤以兩藥合用效果較好，管的長度和節(jié)點均可見明顯增加(表3)。給予AG490后成管能力與對照組比較明顯降低，同時給予黃芪甲苷及阿魏酸后，成管能力增加?？梢?，兩藥合用，有利于體外血管生成。

2.5 p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，模型組給予氯化鈷后，由于造成缺氧損傷，激活JAK-STAT信號通路，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達有所增加，黃芪甲苷、阿魏酸處理后，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達進一步增加。AG490抑制JAK信號通路，因此給藥后，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達降低，阿魏酸及黃芪甲苷，可明顯拮抗AG490對p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達的抑制情況，給藥后p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達明顯增加(結(jié)果見圖5，圖6)。

表2 藥物對HUVEC細胞遷移測定的影響Table 2 Effects of the drugs on HUVEC migration

注：與對照組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001。
Note. Compared with the control group, ▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001.

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。圖4 體外成管情況(× 40)Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV.Figure 4 Angiogenesis in vitro

表3 藥物對HUVEC細胞體外成管作用結(jié)果Table 3 Effects of the drugs on HUVEC angiogenesis in vitro

注：與對照組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，#P< 0.05。
Note. Compared with the control group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,#P< 0.05.

注：1：對照組；2：模型組；3：黃芪甲苷+阿魏酸組；4：阿魏酸組；5：黃芪甲苷組；6：黃芪甲苷+阿魏酸+ AG490組；7：AG490組。圖5 阿魏酸與黃芪甲苷合用對缺氧損傷HUVEC細胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表達的影響Note. 1: Control group; 2: Model group; 3: Astragaloside IV + ferulic acid group; 4: Ferulic acid group; 5: Astragaloside IV group; 6: Astragaloside IV + ferulic acid + AG490 group; 7: AG490 group.Figure 5 Effect of astragaloside IV combined with ferulic acid on the p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in HUVECs

注：FA：阿魏酸；AT：黃芪甲苷。與對照組比較，▲ P< 0.05，▲▲ P< 0.01，▲▲▲ P< 0.001；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與AG490組比較，# P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001。圖6 阿魏酸與黃芪甲苷合用對缺氧損傷HUVEC細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白灰度分析結(jié)果Note. FA: ferulic acid; AT: astragaloside IV. Compared with the control group, ▲ P< 0.05, ▲▲ P< 0.01, ▲▲▲ P< 0.001. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the AG490 group,# P < 0.05,## P < 0.01,### P < 0.001.Figure 6 Effect of astragaloside IV combined with ferulic acid on p-JAK2 and p-STAT3 protein expression levels in the HUVECs

3 討論

血管新生的概念早在《內(nèi)經(jīng)》中就有所記載，即：“生新祛瘀”。生新祛瘀是機體的正常生理功能，相當(dāng)于血液系統(tǒng)的新陳代謝，也可理解為新的血管的再生，即在已有的血管床上，促進內(nèi)皮細胞發(fā)芽長出新支，形成血管網(wǎng)。血管生成不僅與血管內(nèi)皮細胞的增殖有關(guān)，還與血管內(nèi)皮細胞的遷移和管腔的形成密切相關(guān)[6]。阿魏酸是中藥當(dāng)歸的主要活性物質(zhì)，廣泛的存在于植物中的一種酚酸成分，現(xiàn)代藥理作用研究表明其具有明顯的抗血栓、抗氧化等功能[7-9]。無論在常氧或是缺氧狀態(tài)下，阿魏酸均能促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，其對細胞的調(diào)節(jié)功能可能與ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)VEGF、HIF-1α基因等的表達有關(guān)[10-11]。黃芪甲苷是黃芪的主要藥效物質(zhì)，具有顯著的促受損心肌組織血管新生以及內(nèi)皮細胞增殖的作用，其機制與PI3K/Akt信號通路有關(guān)[3-4, 12]。聯(lián)合使用兩藥，可以作用于疾病網(wǎng)絡(luò)中多個靶點，對各靶點的作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，達到最佳的治療效果。為了探究兩藥合用，調(diào)控血管新生作用的協(xié)同機制，我們建立了氯化鈷所致的內(nèi)皮細胞缺氧模型，研究兩藥合用對內(nèi)皮細胞血管形成的影響。本實驗通過預(yù)實驗篩選確定黃芪甲苷與阿魏酸的給藥劑量，采用氯化鈷致內(nèi)皮細胞缺氧模型，考察黃芪甲苷與阿魏酸合用對缺氧損傷細胞的保護作用以及促進血管生成的作用，CCK-8檢測與死活細胞染色結(jié)果表明，阿魏酸組、黃芪甲苷組以及合用組均能提高細胞存活率，兩藥均可保護受損細胞，使細胞形態(tài)保持完整，尤以黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合作用最強具有協(xié)同作用。體外成管及遷移實驗中可看出，黃芪甲苷、阿魏酸均有明顯的促進內(nèi)皮細胞遷移以及成管的能力。

JAK-STAT信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，廣泛調(diào)節(jié)多種疾病的生理過程以及病理過程，參與細胞的增殖、分化、凋亡等許多重要的生物學(xué)過程[13]。JAK2-STAT3信號通路與血管新生作用關(guān)系密切，參與了血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用[14-15]。JAK2-STAT3激活后，STAT3磷酸化明顯增加，明顯上調(diào)HIF-1α和VEGF，促進內(nèi)皮細胞的迂移和血管的形成，有利于血管新生[16-20]。本研究采用Western blot法，從蛋白水平上檢測細胞內(nèi)p-JAK2、p-STAT3的表達情況，結(jié)果顯示給予JAK2抑制劑AG490后，p-JAK2、p-STAT3較正常血管內(nèi)皮細胞表達明顯減少，黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合給藥能顯著誘導(dǎo)JAK2磷酸化表達增加，STAT3磷酸化表達上調(diào)，明顯削弱了AG490對JAK-STAT信號通路的抑制作用?？梢?，黃芪甲苷與阿魏酸聯(lián)合應(yīng)用具有促進缺氧內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管的能力，對缺氧細胞的形態(tài)起到保護作用，有利于血管生成，兩者促進血管新生的機制可能與JAK2-STAT3信號通路有關(guān)。