張菡 ，吳子毅 ，趙抒娜 ，，陳海軍 ，3，楊釗 ，3，王寶 ，

（1.中糧屯河糖業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)部糖料與番茄質(zhì)量安全控制重點實驗室，新疆昌吉831100；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司/老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209；3.中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司，廣西崇左 200040）

0 引言

在制糖過程中，甜菜原料若受到壓傷、凍傷、病蟲危害，或者收后長時間放置，均會感染腸膜明串珠菌、鏈球菌屬等微生物，微生物分泌出的葡聚糖蔗糖酶能夠催化蔗糖生成葡萄糖，葡萄糖則進一步聚合形成葡聚糖（又稱右旋糖酐）。葡聚糖是一種高分子量的多糖聚合物，主要由α-（1→6）糖苷鍵連接，但亦有少量的α-（1→4）、α-（1→3）、α-（1→2）糖苷鍵。 葡聚糖分子量從一萬到幾百萬不等，根據(jù)其大小，可將葡聚糖分為高分子量葡聚糖（＞1 000 kDa）、中分子量葡聚糖（100～1 000 kDa）及小分子量葡聚糖（＜100 kDa）[1]。

葡聚糖含量高時，會對制糖過程產(chǎn)生以下危害：1）降低過濾速度，影響清凈效率，增加糖汁粘度；2）結(jié)晶過程中造成糖蜜粘度增高，影響蔗糖分的結(jié)晶率，使煮糖時間及洗蜜時間延長，增加耗汽量，降低設(shè)備利用率；3）導(dǎo)致蔗糖結(jié)晶異型，C軸扁長，形成易碎的扁狀晶，在分蜜過程中易斷裂，穿過篩網(wǎng)造成損失；同時，這種晶型也會影響洗蜜，造成打水量增多，增加廢蜜量，給制糖生產(chǎn)帶來更大的糖分損失[2-5]。

就如何避免或消除葡聚糖對制糖工業(yè)的負面影響，國內(nèi)甜菜制糖產(chǎn)業(yè)采取了一系列措施，如做好甜菜原料保藏及生產(chǎn)車間衛(wèi)生管理，使用殺菌劑以減少葡聚糖的產(chǎn)生等。但在葡聚糖已經(jīng)產(chǎn)生并影響正常生產(chǎn)的情況下，最有效的處理方法就是加入α-葡聚糖酶，將葡聚糖降解成小分子糖類[6]。據(jù)報告，美國、日本、南非、澳大利亞、印度等國自20世紀(jì)60年代就已開始研究α-葡聚糖酶在制糖中的應(yīng)用技術(shù)[2，7-9]。國內(nèi)廣州甘蔗糖業(yè)研究所成功開發(fā)出葡聚糖濃度快速測定技術(shù)，并將α-葡聚糖酶應(yīng)用在甘蔗制糖生產(chǎn)中[10-12]。陸海勤等[13]使用細麗毛殼菌生產(chǎn)α-葡聚糖酶，并用于甘蔗制糖小試實驗，結(jié)果表明α-葡聚糖酶可有效提高過濾和沉降速度、降低清汁渾濁度和色值。目前，就α-葡聚糖酶在甜菜制糖中的應(yīng)用及效果評估，國內(nèi)外相關(guān)研究較少。

本文針對α-葡聚糖酶在甜菜制糖過程中的使用條件開展了一系列研究工作，為α-葡聚糖酶在甜菜制糖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T-2000購自上海源葉生物科技有限公司；α-葡聚糖酶（活性30 000 U/mL）購自阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)（上海）有限公司；右旋糖酐單克隆抗體免疫比濁檢測試劑盒購自廣州甘蔗糖業(yè)研究所研制；氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、無水乙醇、無水甲醇、鐵氰化鉀、七水合硫酸鋅等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與耗材

濁度計：MCA-Sucrose TM，美國Midland公司；電熱恒溫水浴鍋：DK-S24型，上海森信實驗儀器有限公司；電子分析天平：ME204E，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；加熱磁力攪拌器：RCT，德國IKA公司；紫外可見分光光度計：UV-2800型，尤尼柯（上海）儀器有限公司；水分測定儀：HC103型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：YX-280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司；臺式數(shù)顯pH計：PHS-25，上海雷磁；手持錘度計：MASTER-53a，ATAGO日本愛拓；移液槍：5 mL、1 000 μL、20 μL，德國 Eppendorf；微孔有機濾膜：0.45 μm，美國安捷倫。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液的制備：將葡聚糖放于105℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重，取出放入干燥器內(nèi)并冷卻至室溫，得到無水葡聚糖；通過將無水葡聚糖與一定比例的蒸餾水進行混合，配制得到不同濃度的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

抗體稀釋液 PBS 的配制：稱取 8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.63 g Na2HPO4·12H2O、0.24 g KH2PO4，溶于 900 mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH值7.2，加水定容至1 L，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

抗體溶液的配制：取一盒葡聚糖單克隆抗體，加入13 mL抗體稀釋液，充分搖勻溶解，靜置15 min備用。量取1mL配制好的抗體溶液在濁度計上讀數(shù)，若讀數(shù)大于40 NTU，則必須用0.45 μm濾膜進行過濾。抗體溶液在室溫（25℃）下可保存12 h，當(dāng)天配制當(dāng)天使用。

1.3.2 樣品制備

甜菜浸出汁取自中糧屯河糖業(yè)股份有限公司昌吉糖業(yè)分公司，其錘度為14.2%，糖度為12.6%，純度為88.6%，pH值為6.2。

不含葡聚糖的浸出汁制備方法：取浸出汁放置于恒溫水浴鍋中，在60℃下預(yù)熱15 min，加入過量的α-葡聚糖酶稀釋液（添加比例50 mg酶/kg浸出汁）反應(yīng)30 min，在該條件下，浸出汁中的葡聚糖可全部除去。反應(yīng)結(jié)束后，將浸出汁煮沸40 min進行滅酶。

1.4 葡聚糖濃度的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液測定

采用免疫分析法測定葡聚糖的含量。首先，配制濃度一定的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定時，將1.0 mL抗體溶液加入測試皿中，置濁度計中每5 s讀取一次濁度值，直到讀數(shù)穩(wěn)定不再下降（間隔10 s的兩次讀數(shù)相同），記錄該濁度值作為空白濁度值。然后，加入10 μL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液，用移液槍反復(fù)吹打6次（避免產(chǎn)生氣泡），每5 s讀取濁度值，濁度值會產(chǎn)生先升后降的變化，取最高值為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濁度值；標(biāo)準(zhǔn)溶液濁度值與空白值的示數(shù)之差記為△NTU標(biāo)，即△NTU標(biāo)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濁度值-空白濁度值。

1.4.2 樣品測定

將1.0 mL抗體溶液加入測試皿中，每5 s讀取濁度值，直至讀數(shù)穩(wěn)定不再下降，記錄該濁度值作為空白值。加入10 μL待測樣液，用移液槍反復(fù)吹打6次，置濁度計中每5 s讀取濁度值，取最高值為待測樣品溶液的濁度值，兩次濁度值示數(shù)之差記為△NTU樣，即△NTU樣=樣品溶液濁度值-空白濁度值。

1.4.3 樣品中葡聚糖濃度計算

C樣=C標(biāo)×ΔNTU樣/ΔNTU標(biāo)（C樣為樣品中的葡聚糖濃度；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液的葡聚糖濃度）

1.4.4 葡聚糖去除率測定

葡聚糖去除率（%）=（1-酶解反應(yīng)后浸出汁中的葡聚糖濃度/加酶前浸出汁中的葡聚糖濃度）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫分析法驗證

葡聚糖含量的常用測定方法包括酒精Haze法、Amstar契約法、SPRI法等，這類方法是利用葡聚糖在酒精中發(fā)生沉淀產(chǎn)生渾濁，在一定范圍內(nèi)葡聚糖濃度與溶液渾濁度呈正比關(guān)系，從而可測定葡聚糖含量。此外，葡聚糖檢測方法還包括Robert銅法和酶水解法，前者是利用葡聚糖與苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)測定葡聚糖含量，后者則是使用葡聚糖水解酶將葡聚糖水解成葡萄糖，再通過測定葡萄糖含量推算出葡聚糖含量[14]。

本研究所使用的免疫分析法是一種較為新型的葡聚糖含量檢測方法，其原理是待測樣品中的葡聚糖（抗原）與其抗體會發(fā)生特異性結(jié)合，形成絡(luò)合物并產(chǎn)生濁度；在抗體過量的情況下，則絡(luò)合物形成的濁度與葡聚糖的含量成正比，將待測樣品引起的濁度變化值與標(biāo)準(zhǔn)品引起的濁度變化值進行對比，則可計算得到待測樣品中的葡聚糖濃度[15-16]。與常用的Haze法相比較，免疫分析法具有操作簡單、準(zhǔn)確度高的特點。根據(jù)課題組對酒精Haze法與免疫分析法的使用經(jīng)驗，因甜菜制糖中間汁制品所含各類雜質(zhì)較多，且酒精Haze法檢測所需樣品量較大，因此造成該方法的準(zhǔn)確性較差；而免疫分析法不需要從樣品中預(yù)分離出葡聚糖，每次檢測僅需10 μL樣品量，中間汁雜質(zhì)成分對濁度的影響可忽略不計，因此可獲得快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

表1 免疫分析法加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of immunoassay adding standard substance recovery test

為驗證免疫分析法的準(zhǔn)確性，采用加標(biāo)回收的方法，對100 mg/kg的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液做加標(biāo)回收試驗，即將1 g/kg葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液加入100 mg/kg葡聚糖標(biāo)液中，使其濃度范圍達到100～500 mg/kg，采用免疫分析法測定濁度；以100 mg/kg的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液為基準(zhǔn)計算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，免疫分析法測定葡聚糖的加標(biāo)回收率在93.89%～106.67%之間，平均加標(biāo)回收率為99.48%，準(zhǔn)確性較好。

2.2 α-葡聚糖酶處理甜菜制糖浸出汁的作用條件研究

2.2.1 pH值對降解作用的影響

取不含葡聚糖的浸出汁，加入葡聚糖濃度為20 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制葡聚糖濃度為500 mg/kg的浸出汁溶液，分別裝入 5 個 100 mL 的燒杯中，并調(diào)節(jié) pH 值至 5.0±0.1、6.0±0.1、7.0±0.1、8.0±0.1、9.0±0.1。 將浸出汁轉(zhuǎn)移至比色管，放置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱15 min，分別加入濃度為5 mg/kg的α-葡聚糖酶，搖均反應(yīng)5 min，反應(yīng)完畢后煮沸20 min滅酶，冷卻至室溫并測定葡聚糖濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 pH值對酶解作用的影響Fig.1 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

圖2 α-葡聚糖酶濃度對酶解作用的影響Fig.2 Effect of α-glucanase concentration on enzymatic hydrolysis

由圖1可知，在初始葡聚糖濃度500 mg/kg、α-葡聚糖酶濃度5 mg/kg、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間為5 min時，在pH值為5.0～9.0的范圍內(nèi)，α-葡聚糖酶均有一定的酶解性能；尤其當(dāng)pH值為5.0～7.0時，其對葡聚糖的去除效果最好，去除率達到了80%以上。隨著pH值的進一步升高，葡聚糖去除率大幅下降；當(dāng)pH值達到8.0時，葡聚糖的去除率為60.03%；當(dāng)pH值達到9.0時，α-葡聚糖酶已基本失去活性，去除率不足20%。綜上所述，5.0～7.0為α-葡聚糖酶的最適pH值范圍，加酶工段的操作pH值應(yīng)盡可能保持在8.0以下。另據(jù)Jiménez以及吳兆鵬等的研究，α-葡聚糖酶在pH值5.0左右時活性最高，與本文的研究結(jié)果一致[17-18]。

2.2.2 葡聚糖酶濃度對酶解作用的影響

配制葡聚糖濃度為500 mg/kg的浸出汁溶液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，分別裝入5個50 mL的比色管。將比色管放置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱15 min，分別加入濃度為0 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg的葡聚糖酶并反應(yīng)5 min，冷卻至室溫并測定葡聚糖濃度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)葡聚糖濃度為500 mg/kg、反應(yīng)溫度為60℃、反應(yīng)pH值為5.0、反應(yīng)時間為5 min時，隨著α-葡聚糖酶濃度的增大，反應(yīng)后的葡聚糖量逐漸減低，葡聚糖的去除率逐漸增大。當(dāng)α-葡聚糖酶的濃度為1 mg/kg時，葡聚糖的去除率達到68.35%，說明α-葡聚糖酶的作用效果明顯。當(dāng)α-葡聚糖酶為3 mg/kg以上時，去除率的增加趨勢明顯變緩；當(dāng)葡聚糖酶濃度為5 mg/kg時，葡聚糖的去除率為93.85%；進一步增大α-葡聚糖酶濃度至10 mg/kg，葡聚糖去除率增加至96.98%，增幅較小。鑒于酶制劑價格較高，在甜菜制糖工業(yè)應(yīng)用中，選擇2～5 mg/kg的α-葡聚糖酶濃度較為合適。

2.2.3 葡聚糖濃度對降解作用的影響

分別配制葡聚糖濃度為100 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg、700 mg/kg、1 g/kg的浸出汁溶液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，放置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱15min，加入濃度為5 mg/kg的α-葡聚糖酶并反應(yīng)5min，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在α-葡聚糖酶濃度為5 mg/kg、反應(yīng)溫度為60℃、反應(yīng)pH值為5.0、反應(yīng)時間為5 min的條件下，初始葡聚糖濃度從100 mg/kg增加至1 g/kg時，葡聚糖的去除率均達到90%以上。例如，當(dāng)初始葡聚糖濃度為300 mg/kg時，經(jīng)酶制劑的降解作用，其含量下降至13 mg/kg；當(dāng)初始葡聚糖濃度為700 mg/kg時，經(jīng)酶制劑的降解作用，其含量下降至46 mg/kg。根據(jù)工廠的實際經(jīng)驗，甜菜制糖過程中葡聚糖的濃度通常在1 g/kg以下，因此5 mg/kg的添加量足夠保證去除效果。

圖3 葡聚糖濃度對降解作用的影響Fig.3 Effect of dextran concentration on degradation

圖4 溫度對降解作用的影響Fig.4 Effect of temperature on degradation

2.2.4 溫度對葡聚糖酶降解作用的影響

配置得到葡聚糖濃度為500 mg/kg、pH值為5的浸出汁溶液，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下預(yù)熱15 min，加入濃度為5 mg/kg的α-葡聚糖酶并反應(yīng)5 min，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)葡聚糖濃度為500 mg/kg、α-葡聚糖酶濃度為5 mg/kg、pH值為5.0、反應(yīng)時間為5 min時，在40～70℃的溫度范圍內(nèi)，α-葡聚糖酶均有一定的酶解性能；在50～60℃時作用效果最好，葡聚糖去除率達到93%以上。隨著溫度的進一步升高，葡聚糖去除率大幅下降，當(dāng)溫度達到70℃時，葡聚糖去除率為51.30%；當(dāng)溫度達到80℃時，α-葡聚糖酶已基本失去活性，去除率不足5%。綜上所述，50～60℃為α-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度，加酶工段的操作溫度應(yīng)盡可能控制在70℃以下。據(jù)岑成福等的研究，葡聚糖酶在40～60℃范圍內(nèi)均保持較高活性，對蔗汁中的葡聚糖去除率達到75%以上[19]；另據(jù)Jiménez報道，真菌葡聚糖酶在溫度為50℃時活性最高[17]。上述報道與本文的研究結(jié)論一致。

2.2.5 反應(yīng)時間對降解作用的影響

配制得到葡聚糖濃度為500 mg/kg、pH值為5的浸出汁溶液，在60℃條件下預(yù)熱15 min，加入濃度為5 mg/kg的α-葡聚糖酶，并分別反應(yīng) 1 min、3 min、5 min、7 min、10 min，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在初始葡聚糖濃度為500 mg/kg、α-葡聚糖酶濃度為5 mg/kg、反應(yīng)溫度為60℃、pH值為5.0的條件下，隨著反應(yīng)時間的延長，葡聚糖濃度逐漸減低，葡聚糖的去除率逐漸增大，而變化趨勢則逐漸放緩。當(dāng)反應(yīng)時間為1 min時，葡聚糖的去除率達到75.87%；當(dāng)反應(yīng)時間達到5 min時，葡聚糖的去除率達到93.85%；當(dāng)反應(yīng)時間繼續(xù)延長時，去除率增加緩慢，這一點與岑成福等的研究一致[19]。

理論上，反應(yīng)時間的延長有利于α-葡聚糖酶的降解作用，但在實際生產(chǎn)過程中，因浸出汁呈酸性，停留時間過長會加大蔗糖的轉(zhuǎn)化，不利于白砂糖質(zhì)量和產(chǎn)量的提高。在甜菜制糖生產(chǎn)中，葡聚糖酶的添加位點通常位于浸出汁出口處；浸出汁通過管路輸送至預(yù)灰工段，pH值會快速上升至11.0左右，造成葡聚糖酶的滅活。在甜菜糖廠，浸出汁從浸出器出口流送至預(yù)灰槽的時間通常在5 min左右；為延長酶的作用時間，也可以在浸出器與預(yù)灰槽之間增加緩沖罐。綜合考慮，酶的作用時間以5～10 min較為合理。

圖5 反應(yīng)時間對降解作用的影響Fig.5 Effect of reaction time on degradation

3 結(jié)論與討論

通過本研究可知，使用免疫分析法測定甜菜浸出汁的葡聚糖濃度，具有準(zhǔn)確性高、較為快捷的優(yōu)點。通過研究α-葡聚糖酶對浸出汁的作用條件，得出α-葡聚糖酶的最適濃度為5 mg/kg，最適反應(yīng)溫度為50～60℃，合理作用時間為5～10 min，最優(yōu)pH值范圍為5.0～7.0。甜菜原料的葡聚糖濃度和氣候變化有密切關(guān)系，在氣溫偏高、波動較大的情況下，易導(dǎo)致甜菜反復(fù)凍融，加速微生物滋生，并造成葡聚糖濃度上升。2016/2017榨季后期，因新疆伊犁地區(qū)氣候異常，導(dǎo)致當(dāng)?shù)囟嗉姨鸩颂菑S出現(xiàn)原料葡聚糖濃度升高、中間汁過濾困難的問題；通過α-葡聚糖酶的應(yīng)用，有效解決了工廠的生產(chǎn)難題，保障了低品質(zhì)甜菜的正常加工。

目前，國內(nèi)外對葡聚糖酶在甜菜制糖中的研究報道較少，在甘蔗制糖中則有一些應(yīng)用研究。例如，根據(jù)岑成福等的研究，α-葡聚糖酶在酶劑量為0.05 U/mL蔗汁、pH值5.3、反應(yīng)時間15 min、反應(yīng)溫度51℃的條件下，可將蔗汁中的α-葡聚糖（含量800～900 mg/kg）完全除去[19]。本研究中，在α-葡聚糖酶添加量5 mg/kg（按葡聚糖酶活性為30 000 U/mL計，對應(yīng)酶劑量0.15 U/mL浸出汁）、pH值5.0、反應(yīng)時間5 min的作用條件下，可將浸出汁中的α-葡聚糖（含量100 mg/kg～1 g/kg）除去90%以上。在甜菜制糖實際生產(chǎn)過程中，綜合考慮葡聚糖問題的嚴(yán)重程度以及成本等因素，葡聚糖酶添加量通常控制在2～5 mg/kg（對應(yīng)酶劑量0.06～0.15 U/mL）?？傮w而言，盡管甜菜浸出汁和蔗汁在非糖成分上有一些差異，但葡聚糖酶在甜菜制糖和甘蔗制糖中的最優(yōu)使用條件是基本一致的。

下一步，課題組將在試驗研究的基礎(chǔ)上，進一步收集α-葡聚糖酶在甜菜制糖生產(chǎn)中的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用數(shù)據(jù)，詳細評估葡聚糖酶的工廠使用效果及經(jīng)濟性。