王黎明，楊大業(yè)，仇劍，張德巍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院第三普通外科，沈陽 110032）

肺癌是病死率居世界首位的惡性腫瘤，主要分為小細(xì)胞肺癌 （約占15%） 和非小細(xì)胞肺癌 （約占80%） 兩大類［1-3］。雖然目前外科手術(shù)及聯(lián)合治療有了很大的進(jìn)展，但是其5年生存率仍然不高。

miRNA是長度在18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miRNA在進(jìn)化上高度保守，具有多種生物學(xué)功能，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程有重大影響。與mRNA相比，miRNA代謝周期長，更適合作為腫瘤的標(biāo)記物［4-5］。miR-24在多種腫瘤中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤中miR-24均被發(fā)現(xiàn)有不同程度的下調(diào)［6］，在宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-24也被證明可以顯著地抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7-9］，但是在肺癌中鮮有報(bào)道。本研究擬探討miR-24調(diào)節(jié)肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 （實(shí)驗(yàn)室凍存） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國HyClone公司） ，胎牛血清 （天津?yàn)笊镉邢薰荆?，miR-24擬似物 （CATGAGGGCAGAAACCG ATGCAA） ，miR-24抑制物 （GTTGCATCGGTTTCTGC CCTCATG，廣州銳博生物有限公司） ，臺(tái)盼藍(lán) （上海碧云天生物有限公司） ，噻唑藍(lán) （thiazolyl blue，MTT） ，抗體：周期素依賴性激酶4 （cyclin dependent kinase 4，CDK4） ，周期素依賴性激酶6 （cyclin dependent kinase 4，CDK6） ，基質(zhì)金屬蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP2） 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（美國Santa公司） ，SYBR Green （美國Promega公司） 。

選取本院2010至2015年術(shù)前未接受過放化療的肺癌患者30例，其中，＜45歲8例，≥45歲22例，平均年齡49.25歲 （42～67歲） 。取其腫瘤組織及癌旁組織，組織取下后置于液氮中備用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)中所需的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室凍存，在25 mL 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并加入適量含10%胎牛血清的無抗生素的DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37 ℃的孵箱條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：以1×104/孔的密度將A375細(xì)胞接種于96孔板中，12 h后分別轉(zhuǎn)染miR-24 擬似物/抑制物。處理后分別在0 h、12 h、24 h、36 h和48 h加入MTT，孵育4 h后加入100 μ L DMSO溶解MTT-甲臜結(jié)晶，15 min后，測量490 nm吸光值。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)：對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105每孔的密度接種于Transwell小室中，終體積200 μ L，下室加入600 μ L無血清培養(yǎng)基，12 h后更換培養(yǎng)基，使用不同因素處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，棉簽擦去上層細(xì)胞，95%乙醇固定20 min，0.4 %臺(tái)盼藍(lán)染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blotting：不同因素處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，通過裂解得到蛋白。取等量蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳。90～110 V電泳2 h、4 ℃下100 V轉(zhuǎn)膜1 h，洗膜，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，對(duì)應(yīng)一抗4 ℃晃動(dòng)孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光儀發(fā)光。

1.2.5 實(shí)時(shí)PCR：取適量 （50～100 mg） 組織樣品粉碎組織，加入1 mL Trizol 試劑在室溫下靜置1～5 min。加入0.2 mL氯仿，振搖15 s，室溫靜置2～3 min。離心15 min （12 000g，2～8 ℃） 。吸取上層水相，取0.4～0.5 mL到新的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置5～10 min。離心10 min （12 000g，2～8 ℃）棄上清。加入75 %乙醇，振搖數(shù)次。離心5 min （7 500g，2～8 ℃），真空干燥后，用DEPC處理水30～40 μ L溶解沉淀，55 ～60 ℃孵育10～15 min。測OD值將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。所用引物為miR-24，F(xiàn)：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACCTC-3’，R：5’-GGACT GTCTTGGCATCCATGTAG-3’；U6，F(xiàn)：5’-CTCGCTT CGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)的顯著性比較使用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-24與肺癌的相關(guān)性

檢測30例肺癌組織及癌旁組織的miR-24含量，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中miR-24的表達(dá)量下降約為47.64%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。

生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-24的表達(dá)情況與患者的預(yù)后密切相關(guān)，miR-24表達(dá)較低的患者中位生存期約為30個(gè)月，但是miR-24表達(dá)較高的患者的中位生存期可達(dá)到60個(gè)月，見圖1。

2.2 miR-24對(duì)肺癌增殖的影響

在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中過表達(dá)miR-24或者將miR-24下調(diào)后，使用MTT的方法檢測miR-24對(duì)A549細(xì)胞的增殖影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-24過表達(dá)后可以顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，反之，當(dāng)miR-24下調(diào)后，A549細(xì)胞的增殖得到促進(jìn)，見表1。

2.3 miR-24對(duì)肺癌遷移的影響

在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中過表達(dá)miR-24或者將miR-24下調(diào)后，使用Transwell的方法檢測miR-24對(duì)A549細(xì)胞的遷移影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-24過表達(dá)后可以顯著抑制A549細(xì)胞的遷移，反之，當(dāng)miR-24下調(diào)后，A549細(xì)胞的遷移受到促進(jìn)，見圖2。

圖1 miR-24與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Relationship between overall survival and miR-24 expression in lung cancer patients

2.4 miR-24對(duì)肺癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白的影響

在A549細(xì)胞中分別將miR-24過表達(dá)或者抑制miR-24表達(dá)24 h后，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-24過表達(dá)可以顯著抑制A549細(xì)胞中CDK4/6和MMP2的表達(dá)，反之，當(dāng)miR-24受到抑制后CDK4/6和MMP2的表達(dá)有所上升，見圖3。

表1 miR-24對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 （，n = 3）Tab.1 Effect of miR-24 on the proliferation of A549 cells （，n = 3）

1） P ＜ 0.05 compared with control group.

Control 0.27±0.02 0.44±0.02 0.67±0.02 0.84±0.03 0.96±0.01 miR-24 mimic 0.24±0.03 0.34±0.021） 0.47±0.021） 0.54±0.021） 0.65±0.011）miR-24 inhibitor 0.22±0.02 0.55±0.021） 0.75±0.011） 0.96±0.021） 1.06±0.021）

圖2 miR-24對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 ×200Fig.2 Effect of miR-24 on the migration of A549 cells ×200

3 討論

miRNA具有組織特異性，目前研究［10］報(bào)道指出，let-7c、miR-34、miR-21、miR-143等多種miRNA均在肺癌中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象。這些miRNAs在肺癌組織中表達(dá)降低或者升高，以發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的作用、通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯，促進(jìn)或者抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。

miR-24廣泛存在于哺乳動(dòng)物的多種組織中，在多種腫瘤中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象［11］。有研究［12-14］表明，miR-24在宮頸癌Hela細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；在人類纖維肉瘤中，miR-24可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤的敏感性；miR-24在卡波西肉瘤中異常表達(dá)，可以作為其特異性生物標(biāo)記物；miR-24可以通過抑制二氫葉酸還原酶的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；在K562等細(xì)胞系中，miR-24被證明可以通過抑制E2F2和MYC來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；在乳腺癌細(xì)胞系中，miR-24被證明可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物的敏感性；miR-24與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用后也可以降低化療藥物的使用劑量。

圖3 Western blotting檢測miR-24對(duì)A549細(xì)胞中CDK4/6和MMP2蛋白水平的影響Fig.3 Expression of CDK4/6 and MMP2 in A549 cells after treatment with miR-24 mimic/inhibitor detected by Western blotting

本研究對(duì)30例肺癌患者組織中miR-24的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-24在肺癌組織中的表達(dá)普遍較低。miR-24的表達(dá)情況與患者預(yù)后密切相關(guān)，本研究結(jié)果提示，miR-24表達(dá)較高的患者的預(yù)后較好。在A549細(xì)胞中分別將miR-24過表達(dá)或者抑制表達(dá)后，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果指出，miR-24可以顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果證明，miR-24對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移能力有很強(qiáng)的抑制作用。接下來通過對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4/6和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2的檢測發(fā)現(xiàn)，miR-24可以下調(diào)這些蛋白的表達(dá)，由此可見，miR-24可以通過調(diào)節(jié)CDK4/6和 MMP2蛋白的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果顯示，miR-24可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，這為肺癌的治療提供了新的方向。