黃文輝

（大亞灣經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所澳頭分所，廣東惠州 516081）

0 引言

近年來(lái)，由于信息技術(shù)的迅速發(fā)展，動(dòng)物檢疫技術(shù)也獲得了顯著的進(jìn)步，高通量測(cè)序技術(shù)由于其通量高、速度快、方式靈活被廣泛應(yīng)用在動(dòng)物檢疫研究工作領(lǐng)域中，并且隨著測(cè)序讀長(zhǎng)的增加以及數(shù)據(jù)處理能力的發(fā)展，誕生了許多催生樣品宏基因組特有的算法和工具，促進(jìn)了動(dòng)物檢疫工作的科學(xué)性和有效性。

1 高通量測(cè)序在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用現(xiàn)狀

分析高通測(cè)序技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用現(xiàn)狀，首先應(yīng)明確現(xiàn)有檢疫技術(shù)的瓶頸，以應(yīng)用較為普遍的熒光PCR技術(shù)為例，其具有快速靈敏、易推廣的特點(diǎn)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物疫情檢疫中得到了較好的應(yīng)用，在阻礙病原傳播中具有重要的應(yīng)用意義。但是在病毒實(shí)驗(yàn)條件難以控制的條件下，由于動(dòng)物檢疫病毒缺乏保守的基因標(biāo)記，PCR技術(shù)難以檢驗(yàn)樣品中所有的病原信息。

近年來(lái)，送檢樣本的多樣性以及動(dòng)物發(fā)病疫情的復(fù)雜化，使得實(shí)際的動(dòng)物檢疫工作變得更加困難。例如，復(fù)雜環(huán)境下的禽類(lèi)尸體、發(fā)病炎癥的組織樣本以及動(dòng)物糞便疫苗等，現(xiàn)階段，相關(guān)人員對(duì)樣本的檢疫工作已經(jīng)不僅局限在拭子樣本，動(dòng)物亞型病毒的不確定性極大提高，檢驗(yàn)技術(shù)水平受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于技術(shù)的限制使得疫情爆發(fā)難以控制，如過(guò)去幾年爆發(fā)的豬高溫綜合癥和新生仔豬腹瀉。

針對(duì)上述現(xiàn)狀問(wèn)題，在動(dòng)物檢疫中應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，可提高對(duì)病原體信息的掌握力度，進(jìn)而快速找到問(wèn)題的解決方案，避免疫情的大范圍爆發(fā)，雖然一些病原信息的發(fā)現(xiàn)和高通測(cè)序技術(shù)無(wú)關(guān)，但是宏基因組測(cè)序技術(shù)可增加對(duì)病疫環(huán)境以及宿主攜帶病菌多樣性的了解，為動(dòng)物檢疫工作帶來(lái)應(yīng)用價(jià)值[1]。

2 動(dòng)物檢疫中高通量測(cè)序技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用

2.1 解析病原亞型上的應(yīng)用

以動(dòng)物疫情中的甲型流感為例，基于高通量測(cè)序技術(shù)的全基因組測(cè)序方法對(duì)了解病毒分子的生物學(xué)特征具有重要的應(yīng)用意義，可以有效了解基因組注釋和種群數(shù)據(jù)分析等內(nèi)容。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法在病毒基因組的應(yīng)用中仍然依賴(lài)Hoffman設(shè)計(jì)的引物，并適度擴(kuò)展基因組全長(zhǎng)，或者以每個(gè)基因的特異引物擴(kuò)增8個(gè)基因片段，以此實(shí)現(xiàn)Sanger測(cè)試，然后再進(jìn)行序列的拼接完成對(duì)基因病毒組的構(gòu)建工作，但是，此種方法的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、勞動(dòng)力投入成本高，在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域中的推廣難度較大。

高通量測(cè)序技術(shù)在檢疫樣品中的應(yīng)用，使檢驗(yàn)效率得到了較大的提升。最新的高通量測(cè)序技術(shù)可測(cè)得樣品中97%的甲型流感病毒的全基因組序列，從而證實(shí)了該病毒原為甲型H1N1樣本。此后，陸續(xù)有學(xué)者應(yīng)用不同的測(cè)試方法，對(duì)不同類(lèi)型的A型流感病毒進(jìn)行分析，進(jìn)而使得高通量測(cè)序技術(shù)在解析病原亞型上的應(yīng)用得以改進(jìn)和完善。值得注意時(shí)，在改進(jìn)檢驗(yàn)方法的過(guò)程中，有部分學(xué)者沒(méi)有應(yīng)用特異性PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，直接采用了感染病毒動(dòng)物肺部的RNA樣本進(jìn)行測(cè)序，并綜合利用其它對(duì)比程序，成功解決了動(dòng)物病毒分型問(wèn)題。

2.2 樣本基因組注釋上的應(yīng)用

現(xiàn)階段，樣本宏基因組文庫(kù)中已經(jīng)注釋了較多的新編碼基因，例如生物催化劑基因、抗生素基因以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等，以活性測(cè)定的檢驗(yàn)技術(shù)為準(zhǔn)，其應(yīng)用原理是通過(guò)合適的方法和策略，從基因庫(kù)中獲得所需要的克隆基因。例如，對(duì)動(dòng)物克隆子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，就可利用在選擇培養(yǎng)基上的表型特征進(jìn)行篩選，因此，該方法具有較高的應(yīng)用價(jià)值，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)少量克隆子的有效分許。

而另一種分析方法是基于異源基因的宿主分析，通過(guò)對(duì)突變體的反映進(jìn)行基因觀(guān)察，實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用，進(jìn)而促進(jìn)該技術(shù)在樣本基因組注釋上的應(yīng)用。通過(guò)功能性篩選的方法可簡(jiǎn)單高效地辨別出全長(zhǎng)基因，由此可獲得功能基因的產(chǎn)物，為動(dòng)物檢驗(yàn)領(lǐng)域提供技術(shù)參考。

2.3 樣本群落進(jìn)化特征上的應(yīng)用

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和創(chuàng)新，開(kāi)拓了科學(xué)研究的視野，通過(guò)基因和核酸序列已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大量動(dòng)物病原基因的檢驗(yàn)，為檢疫工作提供了便利條件。而通過(guò)對(duì)動(dòng)物蛋白序列和基因功能的檢驗(yàn)也為相關(guān)人員的研究工作提供了可靠的捷徑，尤其在樣本群落進(jìn)化特征的研究中。以某地動(dòng)物檢疫部門(mén)的樣本群落研究為例，該部門(mén)技術(shù)人員利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)動(dòng)物病毒的多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)病原體的進(jìn)化特征。

基因多樣性信息的獲得為病毒遺傳圖譜的繪制以及實(shí)際的檢驗(yàn)工作提供了理論基礎(chǔ)，而高通量測(cè)序技術(shù)也提升了實(shí)驗(yàn)技術(shù)的準(zhǔn)確性，尤其是針對(duì)低峰病原體的復(fù)雜樣本研究，相關(guān)技術(shù)人員通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確分析可有效發(fā)現(xiàn)未知病原，防止漏檢現(xiàn)象的發(fā)生，進(jìn)而提高了動(dòng)物檢疫工作效率[2]。

3 結(jié)論

綜上所述，高通量測(cè)序技術(shù)在解析病原亞型、樣本基因組注釋以及樣本群落進(jìn)化特征上的應(yīng)用，提升了動(dòng)物檢疫工作的技術(shù)水平和檢疫效率。高通量測(cè)序和宏基因組之間的相互搭配，可有效獲取病原信息，是全面研究動(dòng)物飼養(yǎng)與加工的重要手段，是未來(lái)動(dòng)物檢疫工作中的重要方式方法，促進(jìn)該行業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步。