崔 旭 黃春華

（1.重慶市石柱縣下路街道畜牧獸醫(yī)站，重慶 409100；2.重慶市石柱縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制站，重慶 409100）

血凝素（HA）的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制稱為血凝抑制試驗(yàn)，一種測(cè)定抗原或抗體的技術(shù)。即加入特異性抗體或特異性抗原后，使原有的血凝反應(yīng)被抑制，動(dòng)物疫病方面主要用于H5亞型與H7亞型禽流感、新城疫等疫病的免疫抗體滴度測(cè)定，為免疫程序的制定提供技術(shù)支撐。為現(xiàn)行的家禽調(diào)運(yùn)監(jiān)管政策，H7亞型禽流感監(jiān)測(cè)報(bào)告出省有效期為21天提供指導(dǎo)依據(jù)。此法簡(jiǎn)稱“75μl”法，雖然看似簡(jiǎn)單，但在阿氏液、PBS液、1%紅細(xì)胞制備、抗原驗(yàn)證、4倍病毒抗原回歸試驗(yàn)等方面仍存在許多注意事項(xiàng)，只有做好操作過(guò)程中的每個(gè)細(xì)節(jié)，方能最大限度減少誤差，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)將試驗(yàn)過(guò)程中注意事項(xiàng)簡(jiǎn)單分析以下：

1 實(shí)驗(yàn)前的工作準(zhǔn)備注意事項(xiàng)：

（1）房間溫度應(yīng)恒溫控制在20～25℃，溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)控制在一個(gè)恒定的溫度下完成。

（2）工作臺(tái)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都要徹底消毒，以免造成污染，建議用75%酒精均勻的噴灑工作臺(tái)反復(fù)三遍。

（3）樣品與試劑均應(yīng)提前20min從冰箱取出恢復(fù)至常溫后，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 材料的準(zhǔn)備注意事項(xiàng)

（1）96孔微量反應(yīng)板的選擇，在選擇反應(yīng)板的時(shí)候一定要仔細(xì)觀察是V型還是U型，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)該選著V型反應(yīng)板，當(dāng)不便觀察的時(shí)候可以用手觸摸孔底有尖尖的刺感來(lái)判斷是V型還是U型。

（2）PBS液、阿氏液和1%紅細(xì)胞的制備：阿氏液和PBS液配制過(guò)程中應(yīng)注意酸堿度的調(diào)整，阿氏液pH值應(yīng)調(diào)整在6.1，PBS液pH值應(yīng)該在7.2，配置好的阿氏液和PBS 液經(jīng)高壓滅菌后方可使用，或者4℃保存，但保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)21d。1%紅細(xì)胞配制過(guò)程中，在選擇公雞時(shí)一定要選擇無(wú)特定病原（SPF）公雞3～5只。在洗滌紅細(xì)胞離心機(jī)轉(zhuǎn)速保持在1500轉(zhuǎn)左右約3～5min，轉(zhuǎn)速過(guò)快會(huì)造成紅細(xì)胞破裂造成溶血。洗滌次數(shù)保持在4～8次之間，實(shí)際操作過(guò)程中以離心后的上清液與PBS液保持同等清晰度時(shí)為準(zhǔn)，備用。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意事項(xiàng)

（1）病毒抗原效價(jià)的測(cè)定，每次試驗(yàn)前均應(yīng)檢測(cè)病毒抗原效價(jià)，因?yàn)椴《究乖r(jià)一經(jīng)使用會(huì)隨著使用次數(shù)逐漸降低，在恒溫狀態(tài)下應(yīng)充分保證靜置反應(yīng)時(shí)間在40min后以最后1孔完全凝集狀態(tài)讀取結(jié)果。

（2）倍病毒抗原液的配制及驗(yàn)證，此項(xiàng)是本實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)建，以病毒抗原log2效價(jià)除以4作為抗原稀釋倍數(shù)，例如抗原效價(jià)為log10，則稀釋倍數(shù)為256，驗(yàn)證配制好的4倍抗原液以前2孔完全凝集狀態(tài)，第3孔為半凝集狀態(tài)（出現(xiàn)點(diǎn)狀紅細(xì)胞沉集，淚流狀態(tài)不明顯），第4孔紅細(xì)胞成紐扣狀沉于孔底，紅細(xì)胞完全沉集淚流狀態(tài)明顯下流。若回歸試驗(yàn)未成立，則需重新測(cè)定抗原效價(jià)、配備4倍抗原再次回歸試驗(yàn)直至成立，以最佳狀態(tài)的稀釋倍數(shù)抗原備用。

（3）樣品稀釋，將恢復(fù)常溫的樣品加入到凝集板中，加樣時(shí)槍頭應(yīng)懸空，并一次性排出樣品，做明樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)記。倍比稀釋過(guò)程中，避免槍頭松動(dòng)吸入空氣，產(chǎn)生氣泡，移液器每孔吸放次數(shù)在10次左右，稀釋至第10孔結(jié)束，若操作過(guò)程倍比稀釋不好，會(huì)產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象。

（4）結(jié)果判定，在紅細(xì)胞加入后靜置40min后方可讀取結(jié)果，實(shí)際操作過(guò)程中可以參照對(duì)照紅細(xì)胞孔將呈明顯的紐扣狀沉于孔底、對(duì)照病毒抗原孔出現(xiàn)完全凝集時(shí)，可讀取結(jié)果，讀取結(jié)果時(shí)應(yīng)將反應(yīng)板作45°傾斜，背面墊A4紙作為底色，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。讀取結(jié)果應(yīng)在10min之內(nèi)完成，時(shí)間過(guò)久會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，誤判效價(jià)。