程濤，姚遠，張生，張向寧，張愛輝，楊威，侯崇智

(1 西安市兒童醫(yī)院，西安710002；2 西安交通大學第一附屬醫(yī)院)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA分子，可通過在轉錄、翻譯、染色質以及表觀遺傳學水平調控基因表達，進而參與各類生物學過程[1]。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過影響多種腫瘤細胞生物學過程參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。通過生物信息學對腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據庫中肝癌臨床樣本的轉錄組測序數(shù)據進行分析，發(fā)現(xiàn)位于3號染色體3q22.1區(qū)段的一條lncRNA TMCC1-AS1在肝癌組織中呈高表達且與生存期負相關，提示TMCC1-AS1可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但生物學功能未見報道[4,5]。2018年6月～2018年12月，我們觀察了TMCC1-AS1在不同人肝癌細胞株和正常人肝細胞中的表達變化及沉默TMCC1-AS1對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖、細胞周期、遷移的影響，探討TMCC1-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑 人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細胞株HL-7702均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。TMCC1-AS1干擾RNA(siTMCC1-AS1)及陰性對照干擾RNA(siNC)均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，RNA提取試劑RNAiso Plus購自日本TAKARA公司，轉染試劑PowerFectTM購自美國SignaGen公司，反轉錄試劑HiFiScript cDNA Synthesis Kit和實時熒光定量試劑FastSYBR Mixture購自江蘇康為世紀生物科技有限公司，CCK-8試劑購自日本DOJINDO公司，細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Transwell小室(8 μm)購自美國康寧公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及青霉素鏈霉素雙抗均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人肝癌細胞株與正常肝細胞中TMCC1-AS1的檢測 人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細胞株HL-7702均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用RNAiso Plus試劑提取細胞總RNA，隨后分別采用反轉錄試劑HiFiScript cDNA Synthesis Kit和實時熒光定量試劑FastSYBR Mixture進行逆轉錄和qRT-PCR反應。TMCC1-AS1上游引物為5′-GCCAGAGCGACGGTTGGA-3′，下游引物為5′-GGCTGCGTTCGATGGGTG-3′；以GAPDH為內參，其上游引物為5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3′，下游引物為5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′。PCR反應體系共50 μL：2×FastSYBR Mixture 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中TMCC1-AS1的相對表達量。

1.3 SMMC-7721細胞的TMCC1-AS1 siRNA轉染及轉染后細胞增殖能力、細胞周期比例、遷移能力觀察

1.3.1 SMMC-7721細胞的TMCC1-AS1 siRNA轉染及分組 將SMMC-7721細胞以1×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞融合度達到30%～50%時，參照PowerFectTM試劑說明書分別轉染siTMCC1-AS1及陰性對照siNC，分別記為沉默組和對照組。兩組細胞轉染48 h后，參照“1.2”檢測轉染后兩組細胞中TMCC1-AS1的相對表達量。

1.3.2 轉染后兩組SMMC-7721細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。兩組細胞轉染24 h后，胰酶消化收集細胞，用完全細胞培養(yǎng)液重懸，以2 000個/孔的密度接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組各設置4行(分別對應4個時間點)，每行5個復孔，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時，加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h后，采用酶標儀檢測450 nm處各孔的光密度(OD)值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.3.3 轉染后兩組SMMC-7721細胞周期比例觀察 采用流式細胞術。兩組細胞轉染48 h后，以1×106個/孔密度接種于6孔板中，用預冷的75%乙醇于4 ℃條件下固定過夜，PBS洗滌細胞后，采用細胞周期檢測試劑盒中的碘化丙啶(PI)染色液避光孵育25 min，上流式細胞儀檢測兩組細胞周期，采用FlowJo軟件分析處于不同周期的細胞比例。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 轉染后兩組SMMC-7721細胞遷移能力觀察 采用Transwell小室法。兩組細胞轉染24 h后，收集細胞用無血清細胞培養(yǎng)液重懸，以50 000個/孔的密度接種于Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液作為趨化介質，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定細胞并用0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽小心擦掉Transwell膜內層未遷移細胞，于倒置顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)，以遷移細胞數(shù)表示細胞遷移能力。每組隨機取5個視野計數(shù)，取平均值。

2 結果

2.1 人肝癌細胞株與正常肝細胞中TMCC1-AS1相對表達量比較 人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細胞株HL-7702中TMCC1-AS1相對表達量分別為3.450±0.309、5.340±0.535、4.270±0.252和1.000±0.068，人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相對表達量與正常人肝細胞株HL-7702相比，P均<0.01。

2.2 轉染后兩組SMMC-7721細胞中TMCC1-AS1相對表達量比較 沉默組SMMC-7721細胞中TMCC1-AS1相對表達量為0.34±0.11，對照組為1.00±0.04，兩組相比，P<0.01，提示沉默TMCC1-AS1的SMMC-7721細胞模型成功建立。

2.3 轉染后兩組SMMC-7721細胞增殖能力比較 沉默組培養(yǎng)24、48、72、96 h時的OD值分別為0.316±0.028、0.402±0.033、0.726±0.065、0.934±0.073，對照組培養(yǎng)24、48、72、96 h時的OD值分別為0.362±0.031、0.613±0.048、1.025±0.083、1.384±0.115，兩組相比，P均<0.05。

2.4 轉染后兩組SMMC-7721細胞周期比例比較 沉默組G0/G1期、S期細胞比例分別為62.6%±3.7%、20.4%±1.8%，對照組G0/G1期、S期細胞比例分別為54.4%±3.9%、26.5%±1.9%，兩組相比，P均<0.01；沉默組G2/M期細胞比例為16.4%±1.5%，對照組G2/M期細胞比例為17.6%±1.9%，兩組相比，P>0.05。

2.5 轉染后兩組SMMC-7721細胞遷移能力比較 沉默組與對照組細胞遷移數(shù)量分別為(112±11)個和(188±13)個，兩組相比，P<0.01。

3 討論

肝癌作為臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率在所有腫瘤中居第6位，而死亡率則居第4位。目前認為，肝癌發(fā)生與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、長期酗酒、肝硬化、黃曲霉毒素攝入、代謝性疾病等因素密切相關，但其確切的發(fā)病機制，尤其是分子機制仍不清楚[6]。因此，解析肝癌發(fā)生發(fā)展分子機制、開發(fā)有效的早期診斷和預后標志物以及治療靶點顯的十分迫切和必要。

近年來研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為一類新型的調控分子，在各種腫瘤組織和細胞中異常表達，發(fā)揮致癌作用或抑癌作用，其可通過復雜的調控機制參與包括肝癌在內的各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，已有一大批肝癌相關lncRNAs被鑒定出來，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織和細胞中表達失調，其可通過作用細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移等多種生物學過程參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[9]。研究[10～13]發(fā)現(xiàn)，HULC作為一條經典的肝癌相關lncRNA，在肝癌組織和細胞中表達上調，可通過調控miR-372、p18、SPHK1、ZEB1、USP22、COX-2和HMGA2等下游分子，影響肝癌細胞的增殖、上皮-間質轉化、血管新生、轉移、自噬、化療耐藥等腫瘤生物學行為。研究[14～18]顯示，HOTAIR作為經典的促癌lncRNA，可通過調控SETD2、SUZ12、ZNF198、P14、P16、GLUT1、MMP9、ATG3和ATG7等分子的表達，進而影響肝癌細胞的增殖、侵襲、遷移、葡萄糖代謝、自噬等生物學特性。

TMCC1-AS1是一條長度為3 497 bp的lncRNA，在人類基因組上與蛋白編碼基因TMCC1呈頭對頭排列，二者啟動子區(qū)域重疊，轉錄方向相反。Cui等[4]對TCGA和GEO數(shù)據庫中肝癌和正常肝組織的轉錄組測序數(shù)據和臨床病例資料進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)TMCC1-AS1在肝癌組織中表達上調，其表達水平與患者生存期呈負相關。在另一項研究中，Zhao等[5]對TCGA數(shù)據庫中370例肝癌組織和50例癌旁組織的lncRNA表達譜數(shù)據和臨床資料進行分析，同樣發(fā)現(xiàn)了TMCC1-AS1在肝癌組織中呈高表達，并通過多變量比例風險回歸分析進一步發(fā)現(xiàn)TMCC1-AS1的表達水平與患者的總生存期呈負相關，可作為獨立的預后判斷指標。以上基于生物信息學的研究結果提示，TMCC1-AS1可能作為促癌lncRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但目前仍缺乏直接的生物學實驗證據。本研究首先檢測了TMCC1-AS1在不同人肝癌細胞株中的表達情況，結果顯示人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相對表達量均高于正常人肝細胞株HL-7702，表明TMCC1-AS1可能作為促癌lncRNA參與肝癌發(fā)生發(fā)展。本研究進一步利用RNA干擾技術沉默了SMMC-7721細胞的TMCC1-AS1表達水平，并對細胞增殖能力、細胞周期變化及遷移能力進行檢測，結果顯示，沉默TMCC1-AS1可抑制SMMC-7721細胞的增殖、遷移能力，并誘導細胞周期阻滯于G0/G1期?？傊?，本研究結果表明，TMCC1-AS1在人肝癌細胞株中的上調表達與細胞的惡性腫瘤生物學行為密切相關，其可能通過調控細胞增殖與遷移進而參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，TMCC1-AS1在人肝癌細胞株中表達上調；沉默TMCC1-AS1可抑制人肝癌細胞株的增殖和遷移。本研究初步明確了TMCC1-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能，為進一步探討其作用機制提供了依據。