宋 曦,陳 晶,梁麗英,陳 煒
廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(南寧530023)
四逆湯是漢代張仲景《傷寒論》中所載經(jīng)方,它由附子、干姜、甘草組成,是治療少陰陽虛陰寒證的主方,具有溫中祛寒、回陽救逆的功效。四逆湯集中體現(xiàn)了中醫(yī)扶陽抑陰、扶正祛邪的治則思想,也因其用藥精煉、效驗(yàn)卓著,受到歷代眾多醫(yī)家的推崇繼而成為千古名方。
現(xiàn)代臨床中,四逆湯應(yīng)用廣泛。其中,四逆湯運(yùn)用于心血管系統(tǒng)疾病效果良好,如運(yùn)用于心肌梗死可保護(hù)心肌細(xì)胞,治療心力衰竭可提高心肌收縮力,因此尤為引人矚目[1-3]。除此以外,四逆湯還有廣泛的臨床應(yīng)用,包括治療急性肝衰竭[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗休克[8-9]等。經(jīng)過研究者的不懈努力,四逆湯的藥理作用及其作用機(jī)制的相關(guān)成果頗為豐富,但這些研究成果仍面臨著較大的挑戰(zhàn)。
首先,四逆湯中的君藥附子富含烏頭生物堿,具有心臟毒性,其治療量和中毒量較為接近。中藥組方理論認(rèn)為四逆湯中的甘草具有解毒增效的作用,但其配伍的科學(xué)性及甘草的解毒機(jī)制需要現(xiàn)代藥理學(xué)的進(jìn)一步的揭示。其次以四逆湯為代表的中藥組方方劑,具有多成分、多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn),但就目前的藥物作用機(jī)制研究結(jié)果而言,多數(shù)限定于一些信號(hào)通路中信號(hào)因子的改變,難于在整體上全面的反應(yīng)四逆湯多成分多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)。在此背景下,對四逆湯這種多成分的組方藥物進(jìn)行以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為代表的生物信息學(xué)的研究分析,成為研究者深入研究中藥組方作用機(jī)制的重要策略。以下筆者就近年來關(guān)于四逆湯運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等生物信息分析方法進(jìn)行分析研究的結(jié)果,進(jìn)行一番綜述。
1通過血清代謝組學(xué)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析揭示四逆湯的量效關(guān)系及其作用機(jī)制四逆湯多年來用于治療心血管疾病[10]。四逆湯組方中的附子富含烏頭生物堿,是附子的主要活性成分,因其毒性作用與治療作用接近,故而治療區(qū)間狹窄。但就四逆湯的組方而言,富含烏頭生物堿的附子實(shí)乃君藥,必不可少[11]。且研究也表明,四逆湯保護(hù)心肌細(xì)胞的作用也有賴于附子的存在[12]。在此情況下,評估四逆湯治療心血管疾病的量效關(guān)系就變得迫切而重要了。
為了確定四逆湯的量效關(guān)系,Zhou等[13]使用去甲腎上腺素造成SD大鼠心肌梗死模型,后分別給予成模動(dòng)物高、中、低(四逆湯濃度分別是4.0 g/ml、2.0 g/ml、1.0 g/ml)三個(gè)濃度的四逆湯胃飼。動(dòng)物模型藥物干預(yù)完畢后分別收集動(dòng)物模型的外周血清。對動(dòng)物模型的外周血清進(jìn)行四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用超高效液相色譜(Ultraperformance liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)。并對因此獲得的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判別分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)在內(nèi)的多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,高劑量組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)更接近于模型組,中劑量組和低劑量組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)彼此接近,但低劑量組與正常對照組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)更相近。
隨后對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中確認(rèn)的潛在生物標(biāo)記的水平進(jìn)行方差分析,獲得15個(gè)有統(tǒng)計(jì)意義的潛在生物標(biāo)記物。這些潛在生物標(biāo)記物分別參與氨基酸代謝、葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和膽汁酸代謝。其中一些代謝過程已被證實(shí)參與了四逆湯保護(hù)心肌細(xì)胞的過程[14],但有5類膽汁酸尚屬首次報(bào)道,揭示了四逆湯的量效關(guān)系,并初步揭示四逆湯治療去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死的作用機(jī)制。
2基于代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究四逆湯的藥物作用機(jī)制迄今為止,藥學(xué)的研究模式已經(jīng)從以往的單一藥物作用于單一蛋白因子水平,發(fā)展至藥物同時(shí)作用于多個(gè)蛋白標(biāo)靶[15-16]。這種研究模式轉(zhuǎn)變的背景是因?yàn)檠芯空咴絹碓蕉嗟恼J(rèn)識(shí)到,多種疾病其實(shí)是在多因素共同作用下產(chǎn)生的。這樣的研究模式的轉(zhuǎn)變,一方面促使研究者們尋找更多的切合實(shí)際的研究、分析方法。另一方面,也引導(dǎo)研究者將目光聚焦于中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)(Traditional Chinese Medicine,TCM),其內(nèi)在原因就在于中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的主要用藥是多種藥物組成的復(fù)方方劑,中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的診療理論著眼于整體的“陰陽平衡”。
在此背景下,以四逆湯為代表的中藥組方方劑理所應(yīng)當(dāng)?shù)某蔀槿藗冄芯康膶ο?。Chen等首先就四逆湯及其湯劑中的主要活性成分建立化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,并對其進(jìn)行詳細(xì)的成分注釋。隨后使用阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌損傷小鼠模型,心肌損傷小鼠模型成模后進(jìn)行分組,在給予不同的藥物干預(yù),藥物包括四逆湯、四逆湯三個(gè)組成藥物的活性成分別組合成的方劑、三種藥物的活性成分的單劑。藥物干預(yù)完畢,對各組小鼠的心肌組織處理后進(jìn)行氣相/液相色譜質(zhì)譜分析,所獲代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)合該研究團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果,Chen等獲得了四逆湯中186種活性成分,及39種四逆湯的蛋白靶標(biāo)。隨后,對這些藥物活性成分和蛋白靶標(biāo)進(jìn)行分子鏈接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,最終獲得四逆湯活性成分與蛋白靶標(biāo)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。四逆湯的這些蛋白靶標(biāo)分布于氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等生物過程,且這些蛋白靶標(biāo)中已有部分被其他研究者證實(shí)參與了四逆湯保護(hù)心肌的過程[17]。這個(gè)研究結(jié)果一方面驗(yàn)證了四逆湯可保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷,更重要的是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)的結(jié)合運(yùn)用,深入探討了四逆湯保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的作用機(jī)制,證明了四逆湯組方的科學(xué)性可必要性。
運(yùn)用類似的思路,Chen[18]等對四逆湯的化學(xué)組學(xué)、血清藥物化學(xué)和外源生物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了類似的分析研究,從不同側(cè)面完善四逆湯藥物作用機(jī)制的研究。以血清藥物化學(xué)分析為例,研究者通過血清藥物化學(xué)分析獲得了四逆湯的48個(gè)有效活性成分,接著使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法獲得這48個(gè)有效活性成分的61個(gè)潛在蛋白靶標(biāo)。再使用生物過程和信號(hào)通路富集分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)獲得這61個(gè)潛在蛋白靶標(biāo)所在的10個(gè)生物過程,最終得到四逆湯保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)理[18]。
以上的研究結(jié)果表明:網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析成功的關(guān)鍵在于藥物活性成分對于特定疾病有清晰的藥物作用,此外也需要對特定疾病的生物靶標(biāo)有較為深入且全面的了解。在此基礎(chǔ)上,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,就可將藥物活性成分與疾病的生物靶標(biāo)鏈接起來,進(jìn)而分析藥物治療該疾病的作用機(jī)制。與四逆湯相關(guān)的藥物作用機(jī)制研究已進(jìn)行多年,累積了大量的研究數(shù)據(jù),這也是進(jìn)一步進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)。
3通過數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)分析研究四逆湯的“效-毒網(wǎng)絡(luò)”四逆湯作用機(jī)制研究的深入,為數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)分析提供了豐富且可靠的數(shù)據(jù)來源。李志勇等[19]首先從TCM-GeneDIT數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,獲得與四逆湯中三個(gè)成分(附子、干姜、甘草)相互關(guān)聯(lián)的基因信息。隨后針對這些關(guān)聯(lián)基因在Pubmed中進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,獲得確定的基因相互關(guān)系,并構(gòu)建附子、干姜、甘草相互關(guān)系的基因生物網(wǎng)絡(luò)。接著,使用類似方法進(jìn)行附子“效-毒網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建。最后通過篩選共享基因和通路預(yù)測的方法,分別預(yù)測干姜、甘草調(diào)控附子“效-毒網(wǎng)絡(luò)”的通路。最終李志勇等認(rèn)為,干姜和甘草可能通過影響免疫-炎癥反應(yīng)信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡-自噬信號(hào)通路、神經(jīng)細(xì)胞與心肌細(xì)胞缺血缺氧保護(hù)信號(hào)通路等途徑發(fā)揮拮抗附子毒性的作用。盡管這些結(jié)果仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)分析無疑為今后四逆湯的作用機(jī)制和毒副作用的研究預(yù)測了方向。
吳德坤等[20]則通過文獻(xiàn)檢索的方法,收集四逆湯干預(yù)心肌梗死的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,對這些文獻(xiàn)中提及的納入研究的已被證實(shí)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行匯總,采用KEGG等生物信息學(xué)分析方法,獲得四逆湯干預(yù)心肌梗死的代謝產(chǎn)物譜及代謝通路。這些代謝通路同樣涵蓋了糖、蛋白質(zhì)的最終代謝通路,如三羧酸循環(huán)、氨基酸合成等。研究人員因此認(rèn)為代謝組學(xué)可作為揭示代謝通路的工具,通過選擇適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)分析方法,對中醫(yī)藥的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測和發(fā)現(xiàn)。
4總 結(jié)多年來,中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的組方方劑處境尷尬,一方面兩千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明其有效性,另一方面研究者們?nèi)狈τ行У难芯糠椒ê图夹g(shù)手段對其療效和作用機(jī)制進(jìn)行全面的揭示。以四逆湯為例,其回陽救逆的療效顯著,是著名的經(jīng)方,直至當(dāng)下,其臨床應(yīng)用堪稱廣泛。但四逆湯的主要藥物附子富含烏頭生物堿,又被證明具有明確的毒副作用,因此不免為人詬病。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)于2008年提出[15],主要用于尋找藥物有效成分與靶標(biāo)蛋白之間的聯(lián)系。而代謝組學(xué)研究則對于追溯藥物的作用機(jī)制有著重要作用,它可以全面展示藥物作用后各器官整體的狀態(tài)。代謝組學(xué)研究的興起,與中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)性和完整性有著內(nèi)在的契合。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)結(jié)合,是目前研究中藥組方作用機(jī)制的有效策略。隨著這方面研究的進(jìn)一步拓展,中藥組方的科學(xué)性、毒副作用將會(huì)得到更加清晰的闡述,也將會(huì)使得以四逆湯為代表的中藥組方方劑在臨床的應(yīng)用更加合理。