張渝菡

（漯河市召陵區(qū)畜牧局，河南漯河 462000）

1 犬圓環(huán)病毒大的發(fā)現(xiàn)

在2012年之前，豬圓環(huán)病毒是唯一報(bào)道的感染哺乳動(dòng)物的圓環(huán)病毒。其中圓環(huán)2病毒可以引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥，豬皮炎和腎病。2012年，國(guó)外學(xué)者Kapoor等人通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)從犬的血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型的圓環(huán)病毒，并將其命名為犬圓環(huán)病毒。隨后，在意大利和我國(guó)，學(xué)者們?cè)谌w內(nèi)均分離到了犬圓環(huán)病毒病并獲得該病毒的全基因序列。2017年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)在報(bào)道中將其歸為圓環(huán)病毒屬，并命名為Canine circovirus。

2 犬圓環(huán)病毒的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)

犬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬還包括豬圓環(huán)病毒2型，鴨圓環(huán)病毒、鵝圓環(huán)病毒、金絲雀圓環(huán)病毒、禽白血病病毒等。因此犬圓環(huán)病毒也沒(méi)有囊膜，屬于單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小約為2063nt，比圓環(huán)病毒2的基因多276～277nt。犬圓環(huán)病毒有至少兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，ORF1開(kāi)放閱讀框相對(duì)比較保守一些，ORF2變異程度相對(duì)比較大。ORF1開(kāi)放閱讀框有912個(gè)堿基，編碼犬圓環(huán)病毒的復(fù)制酶，與該病毒的復(fù)制有關(guān)。第二個(gè)開(kāi)放閱讀框主要編碼衣殼蛋白。

3 犬圓環(huán)病毒的基因結(jié)構(gòu)

犬圓環(huán)病毒的基因組長(zhǎng)度約為2063nt，比圓環(huán)病毒1型多304nt，比圓環(huán)病毒2型多276～277nt，比圓環(huán)病毒3型多63nt。犬圓環(huán)病毒主要有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，這兩個(gè)開(kāi)放閱讀框起始密碼子之間的5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)為135nt，并且有保守的非核酸序列TAGTATTAC，這和鳥(niǎo)類(lèi)和豬圓環(huán)病毒的共有序列相似，并且有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在兩個(gè)開(kāi)放閱讀框的終止密碼子的3’端非編碼區(qū)域有203nt。圓環(huán)病毒2型基因組還有一個(gè)編碼的蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4 流行情況

自從美國(guó)首次在犬血清中檢測(cè)到圓環(huán)病毒后，犬血清中的圓環(huán)病毒檢出率高達(dá)2.9%。次年，同樣在美國(guó)，國(guó)外學(xué)者在患病犬肝臟中分離出犬圓環(huán)病毒，并初步鄭密昂犬圓環(huán)病毒的發(fā)作與犬感染其他病有關(guān)[1]。2014年意大利學(xué)者在6只臘腸犬的胃腸道中發(fā)現(xiàn)了犬圓環(huán)病毒，并得出此次臘腸犬爆發(fā)急性胃腸炎很可能與犬圓環(huán)病毒的感染有關(guān)。國(guó)外學(xué)者在對(duì)2009年到2013年收集的32份狐貍血清樣品中發(fā)現(xiàn)了一種圓環(huán)病毒，并且圓環(huán)病毒的檢出率非常高，高達(dá)62.5%，經(jīng)過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)該病毒與犬圓環(huán)病毒的同源性高達(dá)89%。2016年我國(guó)學(xué)者首次在大陸從犬血清中檢測(cè)到犬圓環(huán)病毒，經(jīng)過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的犬圓環(huán)病毒與歐美各國(guó)發(fā)現(xiàn)的賭注屬于不同的進(jìn)化分枝。

5 致病性和臨床癥狀

研究表明，犬圓環(huán)病毒主要與犬出血性腹瀉、壞死性血管炎有關(guān)系，病毒主要存在于腸道內(nèi)部，有的還存在于肝臟、脾臟和淋巴等組織內(nèi)部。另外，犬圓環(huán)病毒有可能是淋巴結(jié)肉芽腫的致病因子。犬圓環(huán)病毒的臨床癥狀與圓環(huán)2型引起的豬的皮炎與腎病綜合征在臨床癥狀和病理變化上都非常相似。

6 檢測(cè)方法

6.1 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)是用已知堿基序列并帶有標(biāo)志物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)的核酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性結(jié)合形成雜交體，在通過(guò)與標(biāo)志物相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)體系去檢測(cè)，通過(guò)顯微鏡觀察便可以看到雜交信號(hào)并且可以在顯微鏡下對(duì)靶基因進(jìn)行定位。

6.2 熒光定量PCR技術(shù)

國(guó)外學(xué)者對(duì)犬圓環(huán)病毒分別建立了Replicate 和Capsid基因的熒光定量探針?lè)椒?，也有學(xué)者根據(jù)犬圓環(huán)病毒NY21基因的序列設(shè)計(jì)引物并建立了SYBR Green熒光定量檢測(cè)方法。熒光定量檢測(cè)方法快速，簡(jiǎn)便，靈敏度非常高，在臨床上和日常檢測(cè)中很常用。

6.3 常規(guī)PCR方法

PCR方法是檢測(cè)病毒和細(xì)菌常用的檢測(cè)方法之一，PCR方法以其快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在犬圓環(huán)病毒檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛。國(guó)外學(xué)者Gentil等根據(jù)犬圓環(huán)病毒的基因序列設(shè)計(jì)出了特異性引物進(jìn)行PCR方法檢測(cè)，結(jié)果表明，在患有腹瀉的犬中犬圓環(huán)病毒的檢出率達(dá)到20.1%，健康組的犬中，犬圓環(huán)病毒的檢出率只有7.3%。

6.4 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR檢測(cè)技術(shù)，其原理是在同一反應(yīng)管中加入多對(duì)引物，可以同時(shí)檢測(cè)兩種以上的病種，從而達(dá)到特異性檢測(cè)犬圓環(huán)病毒的目的。這種方法快速，簡(jiǎn)便，靈敏，在臨床上和實(shí)際工作中應(yīng)用非常廣泛。

6.5 病毒的分離鑒定

將病死的犬組織進(jìn)行研磨，并反復(fù)凍融3次，之后8000rpm離心15min，取上清，將上清用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后接種于細(xì)胞，3d后，取細(xì)胞培養(yǎng)物，用間接免疫熒光方法或者PCR方法即可檢測(cè)出犬圓環(huán)病毒。

6.6 間接免疫熒光

間接免疫熒光方法主要是利用已知的犬圓環(huán)病毒抗原來(lái)檢測(cè)待檢血清中的抗體以及病變組織和犬圓環(huán)病毒感染情況。這種檢測(cè)方法成本較低，且簡(jiǎn)單快捷。但是實(shí)際操作非常復(fù)雜，不適合臨床檢測(cè)。

6.7 免疫組織化學(xué)方法

免疫組織化學(xué)方法和間接免疫方法一樣，是一種免疫染色方法，其原理是抗原抗體結(jié)合后，利用酶細(xì)胞化學(xué)的一種手段檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物的一門(mén)新的技術(shù)。免疫組織化學(xué)方法可以對(duì)攜帶的抗原的細(xì)胞或者組織的形態(tài)進(jìn)行大體的評(píng)價(jià)，而且只需要普通的顯微鏡就可以觀察出來(lái)，且顏色穩(wěn)定，樣品也容易保存起來(lái)。