付 慧,陳 鵬,龐健健

1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化與分子教研室(西安 710021)；2.西安市胸科醫(yī)院肺結(jié)核二科(西安 710100)

肺部疾病以肺部感染性疾病及肺癌常見。肺部感染指包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)炎癥，肺部感染一直位于各類感染的首位,急性呼吸道感染造成的死亡人數(shù)為總疾病造成死亡數(shù)的第3位。病因以細(xì)菌及病毒感染最為常見(80%)，還可由理化、免疫及藥物引起。病原體診斷是治療方案的基礎(chǔ)，預(yù)后判斷的依據(jù)。資料顯示，50%的肺癌患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期。對(duì)肺癌患者采取早期診斷及治療不僅有助于提高生存率，在改善患者的預(yù)后方面也有積極作用。肺癌確診常通過細(xì)胞學(xué)與病理組織學(xué)，但標(biāo)本獲取的難度大。

在支氣管鏡應(yīng)用的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)技術(shù)可以獲得氣管鏡所不能探及的下氣道的細(xì)胞和溶質(zhì)，能更全面的反映肺部的整體情況，有“液性肺活檢”之稱[1]?；诟咄繙y(cè)序的支氣管肺泡灌洗液的研究可以準(zhǔn)確全面地反應(yīng)下呼吸道微生物群的存在，對(duì)肺部感染的診斷具有重要的意義，而檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液腫瘤標(biāo)志物成為了肺癌輔助診斷的關(guān)鍵措施。

高通量測(cè)序(High-throughput sequencing)或深度測(cè)序(Deep sequencing)，通量高是其技術(shù)最大的特征，同時(shí)測(cè)定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列，大大加快了宏基因組測(cè)序的速度，從而可以極大地降低單個(gè)堿基測(cè)序的成本，又稱之為下一代測(cè)序(NGS)[2]。大量科研工作表示，基于16S擴(kuò)增子及微生物的全基因組測(cè)序，在診斷病原微生物方面，具有快速、不用培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，并在腫瘤相關(guān)DNA與RNA的檢測(cè)方面也有著其他基因?qū)W手段無法比擬的優(yōu)勢(shì)。

近年來，應(yīng)用高通量測(cè)序檢測(cè)BALF在肺部疾病的診斷與治療方面有突破性的應(yīng)用。

1 明確正常肺部菌群及各種肺部疾病的微生物群

由于檢測(cè)技術(shù)的受限，人們長(zhǎng)久以來以為肺部是無菌環(huán)境。最近，使用新的與培養(yǎng)無關(guān)的基于NGS的微生物鑒定技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，在健康和疾病狀態(tài)，肺部具有不同的微生物群落。這一啟示挑戰(zhàn)了許多關(guān)于呼吸系統(tǒng)健康以及傳染性和非傳染性肺病發(fā)病機(jī)制的假設(shè)。人們認(rèn)識(shí)到呼吸道是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，它為肺微生物學(xué)領(lǐng)域注入了新的假設(shè)和疾病發(fā)病機(jī)制的新模型概念。

基于大量的NGS檢測(cè)的結(jié)果，上呼吸道有大量厭氧菌和好氧菌定植 。在使用NGS技術(shù)分析來自健康成人的BALF中的細(xì)菌后顯示，肺中最常見的細(xì)菌門是擬桿菌、厚壁菌和變形桿菌。肺中的優(yōu)勢(shì)屬包括普氏菌、韋氏菌、假單胞菌、梭桿菌和鏈球菌[3]。通過分析口腔清洗液、BALF、鼻拭子和胃吸出物樣品中微生物群的組成，發(fā)現(xiàn)呼吸道含有均勻的微生物群，從上呼吸道到下呼吸道的生物量逐漸減少。肺部微生物群更接近口腔和鼻拭子微生物群，提示肺部微生物群可能通過呼吸來自上呼吸道[4]。尚未確定健康受試者的肺微生物組在地理上是否有變化。一項(xiàng)分析來自美國(guó)8個(gè)城市的健康受試者的肺微生物群的研究未發(fā)現(xiàn)地理聚類的證據(jù)，英國(guó)志愿者中檢測(cè)到的最豐富的微生物群落與健康的美國(guó)受試者相似。

隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，肺微生物組的發(fā)現(xiàn)顛覆了我們對(duì)肺炎發(fā)病機(jī)制的理解。肺炎不是反映病原體對(duì)無菌空間的侵襲，而是一種微生物多樣性和豐度的變化，人們對(duì)患病肺部的微生物組及其與疾病的關(guān)系也有了更加深刻的理解。

許多關(guān)于哮喘患者的研究已經(jīng)確定患者肺部微生物群的組成與健康對(duì)照不同[5]。哮喘患者中部分存在慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，即使患有輕微疾病也可檢測(cè)到氣道微生物群的改變，一旦COPD嚴(yán)重程度提高，氣道微生物群就會(huì)持續(xù)改變[6]。大多數(shù)對(duì)晚期COPD患者的研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道微生物組從擬桿菌門常常變?yōu)樽冃尉T，如假單胞菌、嗜血桿菌等。高豐度的變形菌和較高豐度的擬桿菌，可能是該疾病的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)因子。特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性致死性重塑肺病，其特征在于肺功能的進(jìn)行性下降。有許多證據(jù)支持IPF的病因和進(jìn)展與肺微生物群和細(xì)菌感染的變化有關(guān)[7]。與對(duì)照組相比，在IPF患者的BALF中可檢測(cè)到細(xì)菌負(fù)荷增加，并且在人和小鼠模型中發(fā)現(xiàn)鏈球菌、肺炎球菌或葡萄球菌分類群的豐度相對(duì)增加[8]。最近的兩項(xiàng)研究表明，肺微生物組與IPF預(yù)后之間存在關(guān)聯(lián)，觀察到特定微生物群落成員(葡萄球菌屬和鏈球菌屬)的相對(duì)豐度與疾病進(jìn)展之間的正相關(guān)。發(fā)現(xiàn)BALF中的總細(xì)菌負(fù)荷與病死率呈正相關(guān)，高細(xì)菌負(fù)荷與6個(gè)月的肺功能下降的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這是目前IPF的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)之一。肺囊性纖維化(Cysticfibrosis，CF)是一種遺傳性疾病。肺部CF綜合征表現(xiàn)為支氣管擴(kuò)張和阻塞性肺病的逐漸發(fā)展。肺微生物群與CF的發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。但在臨床穩(wěn)定性和急性加重期間，幾乎所有年輕CF患者的肺中都可以檢測(cè)到特定的呼吸道病原體，如金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。因此，CF的惡化一直被認(rèn)為是細(xì)菌感染的結(jié)果。Edith T.Zemanick等用16S測(cè)序的方法從13個(gè)CF中心檢查了191個(gè)BALF樣本，其中傳統(tǒng)的CF分類群(例如假單胞菌、葡萄球菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)占優(yōu)勢(shì)[9]。Lee等對(duì)肺癌患者和良性腫塊樣病變患者的BALF中微生物組進(jìn)行了表征和比較，Veillonella屬和Megasphaera屬顯示出作為預(yù)測(cè)肺癌的生物標(biāo)志物的潛力[10]。

2 確定肺部疾病的特殊病原菌

除了確定微生物構(gòu)成外，高通量測(cè)序在病原菌檢測(cè)方面有以下優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用：不用培養(yǎng)可以通過DNA的檢測(cè)快速協(xié)助臨床明確病原體；發(fā)現(xiàn)新的病原體；獲得更多病原體信息；宏基因組測(cè)序可以精確到菌種的水平。除此之外，可以對(duì)毒力及耐藥進(jìn)行預(yù)測(cè)；實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的定量研究等。已經(jīng)有大量肺部感染病例基于NGS的方法檢測(cè)BALF明確致病菌并指導(dǎo)治療。

劉金榮等回顧性分析675例兒童期難治性肺炎支原體肺炎兒童的病歷，分別用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和下一代測(cè)序(NGS)檢測(cè)675例患者和18例患者的支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)菌，NGS結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果一致[11]。侵襲性肺曲霉病(IPA)是一種嚴(yán)重的傳染病，病死率很高。然而，IPA的臨床診斷很困難，因?yàn)楹茈y獲得微生物學(xué)證據(jù)。賀醫(yī)生報(bào)導(dǎo)利用NGS(BGISEQ-500/100測(cè)序平臺(tái))的方法，檢測(cè)3例侵襲性肺曲霉病患者的BALF，檢測(cè)出煙曲霉的DNA。這3例病例的臨床試驗(yàn)均為陰性，因此強(qiáng)烈建議NGS可以作為替代診斷方法或補(bǔ)充方法，以幫助臨床醫(yī)生做出適當(dāng)?shù)臎Q定[12]。Ricna等報(bào)道使用靶向不同真菌rDNA區(qū)域的兩種方法，并且直接或在克隆后對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。總共測(cè)試了104例患者的106個(gè)BALF樣本，結(jié)果顯示直接測(cè)序法具有優(yōu)越性[13]。黃等利用NGS技術(shù)對(duì) 2 例可疑肺結(jié)核病及肺非結(jié)核分枝桿菌病的肺部感染患者進(jìn)行明確診斷[14]。除了診斷細(xì)菌之外，在病毒的診斷方面，NGS也具有自己的優(yōu)勢(shì)。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普通重癥監(jiān)護(hù)室的魏等人報(bào)告了首例通過下一代支氣管肺泡灌洗液測(cè)序檢測(cè)到的急性造血功能衰竭患者的肺部皰疹病毒的病例。入院時(shí)收集的用于細(xì)菌培養(yǎng)的血液和痰樣品顯示在2 d后沒有細(xì)菌生長(zhǎng)。采用NGS作為輔助診斷方法，最終該患者被診斷患有侵襲性肺皰疹病(Sapiospermum)和急性造血功能衰竭[15]。2018年有人報(bào)道，1例22歲的男子逐漸出現(xiàn)發(fā)燒，咳嗽，下肢無力，黃疸和皮疹，為期3個(gè)月的臨床全面檢查未能得出診斷結(jié)果。入院后，實(shí)驗(yàn)室和放射學(xué)檢查顯示患者的大腦、脊髓和肺部有多處病變。對(duì)患者的皮膚組織、骨髓、血液和腦脊液進(jìn)行了NGS，這些測(cè)序均鑒定出大量的馬爾尼菲氏鐵桿菌核苷酸序列，從而進(jìn)行了診斷和治療[16]。及早明確感染微生物，對(duì)治療有更積極的意義。邢等對(duì)重癥監(jiān)護(hù)室120例重癥下呼吸道感染患者進(jìn)行分析,將患者分成實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組各60例患者,常規(guī)組采用美羅培南降階梯經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗菌治療,實(shí)驗(yàn)組采用NGS技術(shù)測(cè)定BALF和痰液明確病原微生物后選用相應(yīng)的抗菌藥物進(jìn)行治療。對(duì)比兩組治療效果、不良反應(yīng)發(fā)生情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組治療效果明顯好于常規(guī)組，實(shí)驗(yàn)組不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于常規(guī)組。綜上，在重癥下呼吸道感染病例治療中采用NGS技術(shù),可以及早明確病原，指導(dǎo)抗菌藥物應(yīng)用，降低耐藥菌株的耐藥性。

3 檢測(cè)BALF中的非編碼RNA用來協(xié)助診斷疾病及判斷疾病的發(fā)生發(fā)展

最近的許多證據(jù)表明miRNA和lncRNA在調(diào)節(jié)肺發(fā)育并維持平衡起重要作用。在小鼠和人肺發(fā)育期間，已經(jīng) 觀察到miRNA表達(dá)的廣泛變化。還已知miRNA和lncRNA表達(dá)模式在病理狀態(tài)中改變，例如肺癌、肺部炎癥和各種肺病。

RNA可以容易地從肺組織中提取，例如活組織檢查或刷洗，并且在BALF中RNA也以相對(duì)高的濃度存在。 Weber JA等檢測(cè)了12種液體中miRNA的光譜：血漿、唾液、淚液、尿液、羊水、初乳、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、腹膜液、胸膜液和來自正常人的精液，確定在BALF中，能檢測(cè)出高濃度的microRNA[17]。

有人鑒定與IPF相關(guān)的microRNA生物標(biāo)志物，來自BALF外泌體中microRNA的表達(dá)模式評(píng)估了老年IPF患者的情況。使用NGS檢測(cè)microRNA的表達(dá)，結(jié)果表明miR-125b、miR-128、miR-21、miR-100、miR-140-3p和miR-374b在IPF患者中上調(diào)，而let-7d、 miR-103、miR-26和miR-30a-5p下調(diào)。進(jìn)一步檢測(cè)miR-30a-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BALF中miR-30a的表達(dá)降低,其靶基因所表達(dá)的蛋白TAB3增加可能是IPF進(jìn)展的關(guān)鍵因素[18]。王梓等對(duì)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的30例重癥肺炎患者和10例需要機(jī)械通氣的非呼吸道感染患者，收集BALF標(biāo)本。在兩組的患者進(jìn)行的miRNA篩選,發(fā)現(xiàn)BALF中的 miR-127-5p 可用作診斷重癥肺炎的新生物標(biāo)志物。甲型流感病毒能引起嚴(yán)重的呼吸道感染和肺泡上皮損傷，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征。Nicoletta Scheller等的實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，EV)通過miRNA的轉(zhuǎn)移介導(dǎo)炎癥。Scheller等發(fā)現(xiàn)甲流誘導(dǎo)的呼吸窘迫綜合征患者的支氣管肺泡灌洗液中EV的miRNA組成發(fā)生了顯著變化。在9種顯著失調(diào)的microRNA中，miR-17-5p在患者的BALF和IAV感染的肺上皮細(xì)胞(A549)的EV中上調(diào)。在這些細(xì)胞中，miR-17-5p的轉(zhuǎn)移強(qiáng)烈下調(diào)抗病毒因子Mx1的表達(dá)并顯著增強(qiáng)IAV復(fù)制[19]。H Burke等從14名健康戒煙者和17例年齡匹配的輕度至中度COPD患者中分離出BALF，使用Illumina Next Seq500對(duì)EV miRNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miRNA靶向基因是促炎癥和凋亡途徑的核心基因。通過遞送包裝在EV中的差異表達(dá)的miRNA，AEC與肺泡巨噬細(xì)胞之間存在新的相互作用[20]。 除此之外,黃等使用支氣管刷標(biāo)本中的microRNAs，還能區(qū)分小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，以及進(jìn)一步區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。

以上研究很多都是基于RNA-seq的方法。RNA-seq是一種相對(duì)較新的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，依賴于下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)，NGS在檢測(cè)ncRNA檢測(cè)方面的主要優(yōu)點(diǎn)是不需要先前對(duì)靶ncRNA 的了解，也不要特異性引物或探針。一些制造商提供具有不同技術(shù)的高通量NGS平臺(tái)?；贜GS的RNA-seq目前是miRNA和lncRNA檢測(cè)的最佳平臺(tái)。通過單核苷酸分辨率，RNA-seq在全基因組范圍內(nèi)工作，可以精確鑒定和定量RNA。與基于探針的微陣列相比，RNA-seq具有更大的動(dòng)態(tài)范圍(可能無限， 取決于足夠的測(cè)序深度)，并提供檢測(cè)具有非常低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的能力[21]。然而，這種方法確實(shí)受到一些限制。它相對(duì)昂貴，并且下游數(shù)據(jù)分析非常重要。

4 檢測(cè)BALF中的cfDNA

宮等評(píng)估了BALF在肺癌液體活檢中的潛在用途。納入56例肺癌患者，收集57個(gè)BALF(分離的上清液和沉淀物)樣品和56個(gè)外周血淋巴細(xì)胞樣品，獲得57個(gè)福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織。在匹配的組織DNA，BALF上清液cfDNA和BALF沉淀DNA中使用NGS檢測(cè)1021個(gè)基因，鑒定白細(xì)胞DNA作為體細(xì)胞突變的對(duì)照?？偣苍谀[瘤樣本中鑒定出195個(gè)突變，其中在匹配的BALF沉淀樣品中檢測(cè)到147個(gè)(75.4%)突變，在匹配的BALF上清液樣品中檢測(cè)到168個(gè)(86.1%)突變，在三種類型的樣品中共享145個(gè)(74.4%)的突變。計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷，組織與BALF沉淀物之間的一致性為90%，組織與BALF上清液之間的一致性為94%[22]。作者認(rèn)為，使用BALF進(jìn)行液體活檢對(duì)分析肺癌患者的基因遺傳改變具有較高的潛力，可實(shí)施并標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞將大量EV釋放到含有生物活性分子(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì))的體液中。與使用cfDNA相比，使用BALF EV DNA的液體活檢是組織特異性的并且極其敏感。在Hur等人最近的一項(xiàng)研究中。通過液體活檢，從血漿和BALF中分離的EV用于對(duì)EGFR狀態(tài)進(jìn)行基因分型，與cfDNA分析相比，具有更高的準(zhǔn)確性，表現(xiàn)出更高的特異性和靈敏度[23]。此外，與用于檢測(cè)對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生抗性的患者中的p.T790 M突變的組織重新檢測(cè)相比，使用BALF EV DNA還表現(xiàn)出更高的效率。這些發(fā)現(xiàn)表明使用EV DNA進(jìn)行液體活檢的可能會(huì)取代目前的診斷方法，從而獲得更準(zhǔn)確、更便宜和更快速的結(jié)果。

隨著測(cè)序技術(shù)的提高及成本的降低，NGS大量被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床中。BALF來源于支氣管，能反映肺部健康及疾病的狀態(tài)，使用NGS技術(shù)檢測(cè)BALF中的DNA及RNA，所需時(shí)間短，可以反復(fù)取材，可以用來診斷、評(píng)估、預(yù)測(cè)肺部疾病，包括各類型感染性疾病及肺部腫瘤。為臨床診療提供了新的實(shí)用性的技術(shù)。