陳載鑫,莫綺雯,梁潔如,范 妤,許紅麗,謝嶺平,尹沃河,付文金

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市厚街醫(yī)院,廣東 東莞 523900;2.湖南省邵陽市武崗市人民醫(yī)院,湖南 邵陽 422400）

心臟驟停(CA）是臨床上最嚴(yán)重且最緊急的危險(xiǎn)狀態(tài),搶救成功率低。2015年我院相繼成立卒中中心和胸痛中心,目前心肺復(fù)蘇器等先進(jìn)設(shè)備的投入使用及心肺復(fù)蘇技術(shù)(CRP）的規(guī)范化普及,使我院心肺復(fù)蘇成功率明顯提高。自2015年以來,183例心臟驟?；颊哂?5例心肺復(fù)蘇成功,但大多數(shù)患者恢復(fù)自主循環(huán)(ROSC）后因缺氧、酸中毒及隨后的缺血再灌注等造成的腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度及預(yù)后判斷仍是醫(yī)學(xué)上的難點(diǎn)。全身缺血再灌注損傷激活的炎癥免疫反應(yīng)是CA/CRP后腦損傷的重要發(fā)病機(jī)制,其中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在這個(gè)過程中扮演重要角色[1]。CA 后早期對(duì)腦損傷程度及預(yù)后的評(píng)價(jià)將影響ROSC 后的治療方案,對(duì)嚴(yán)重不可逆的腦損傷患者是否進(jìn)行持續(xù)的生命支持將涉及經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的一系列問題。目前臨床常用p H 值、乳酸、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE）和乳酸清除率等評(píng)估患者的缺血、氧和損傷程度,并判斷預(yù)后[2-3],缺乏特異的血清標(biāo)志物。因此,尋找可靠、實(shí)用的CA 后腦損傷早期損傷程度及評(píng)價(jià)預(yù)后的標(biāo)志物至關(guān)重要。

國內(nèi)聯(lián)合檢測(cè)血清中S100A8/A9 和HMGB1 水平,用于評(píng)估CA/CRP 后缺血再灌注等造成腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度及預(yù)后判斷,尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過檢測(cè)心肺復(fù)蘇患者血清S100A8/A9和HMGB1濃度變化及相關(guān)性,探討這兩種標(biāo)記物與心肺復(fù)蘇后缺血再灌注中腦損傷程度及預(yù)后判斷的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

選取2018年10月 至2019年5月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市厚街醫(yī)院收治的心跳驟停CRP 成功后仍需進(jìn)行腦復(fù)蘇的患者50例。根據(jù)格拉斯哥-匹茲堡腦功能表現(xiàn)分級(jí)(CPC）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),將患者分為預(yù)后差組(CPC3～5 級(jí),24例）和預(yù)后良好組(CPC1～2級(jí),26例）,兩組患者年齡分別為(55.6±4.3）歲和(55.2±4.5）歲,組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。選取年齡為(55.6±4.4）歲的50例正常健康體檢人群為對(duì)照組。

2 研究方法

2.1 檢測(cè)指標(biāo) 檢測(cè)患者和健康體檢者的血清S100A8/A9和HMGB1 水平。分別在患者入院時(shí),CRP成功時(shí)、CRP24 h、CRP48 h抽取靜脈血3 mL,然后立即分離血清并保存至－70℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA）檢測(cè),試劑盒購自上海BoGoo生物技術(shù)有限公司。ELISA 操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,具體操作流程如下:①待測(cè)樣品孔和對(duì)照組孔中每孔加入待測(cè)樣品100μL,每種樣品設(shè)3 個(gè)平行孔,設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μL;②將酶標(biāo)板放置于4℃冰箱中,包被過夜;③洗板:用移液器吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液漂洗1遍,然后將洗滌液緩慢加滿板孔后繼續(xù)浸泡1～2 min,緩慢搖動(dòng),吸出孔內(nèi)液體,然后在紙上拍干,重復(fù)漂洗3～4次;③加入抗體:陰性對(duì)照孔每孔加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS）50μL,樣品孔每孔加入1∶500稀釋的抗體工作液50μL;然后將酶標(biāo)板置于37 ℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60 min,洗板;⑤每孔加1∶5 000 稀釋的HRP-標(biāo)記的二抗工作液100μL,將酶標(biāo)板置37 ℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60 min,洗板;⑥每孔加3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB）顯色液100μL,輕輕混勻10 s,置37 ℃暗處反應(yīng)15～20 min,每孔加100μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng);⑦分別測(cè)450 nm 吸光值W1和630 nm 吸光值W2,最終測(cè)得的OD 值為兩者之差(W1-W2）,以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 記錄檢測(cè)標(biāo)本(S,包括檢測(cè)組和正常對(duì)照組）和陰性對(duì)照(N）的OD 值后。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 結(jié)果 預(yù)后差組和預(yù)后良好組患者血清中S100A8/A9、HMGB1的表達(dá)水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）,預(yù)后差組和預(yù)后良好組S100A8/A9、HMGB1的表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。見表1。

表1 兩組心跳驟停心肺復(fù)蘇成功后仍需進(jìn)行腦復(fù)蘇的患者和正常對(duì)照組人群的S100A8/A9、高遷移率族蛋白B1的表達(dá)水平比較(μg/L,±s）

表1 兩組心跳驟停心肺復(fù)蘇成功后仍需進(jìn)行腦復(fù)蘇的患者和正常對(duì)照組人群的S100A8/A9、高遷移率族蛋白B1的表達(dá)水平比較(μg/L,±s）

注:與正常對(duì)照組比較,P＜0.05;與預(yù)后差組比較,P＜0.05

3 討論

S100蛋白是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白混合物,S100A8、S100A9通常以鈣離子依賴性方式形成異源二聚體(S100A8/A9）蛋白復(fù)合物,具備細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)活性參與細(xì)胞遷移、花生四烯酸代謝、骨髓細(xì)胞成熟等生物學(xué)過程,S100A8/A9參與CA 心肺復(fù)蘇腦損傷的早期過程[4]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1）為細(xì)胞內(nèi)的一種非組蛋白,當(dāng)細(xì)胞壞死或受損時(shí),核內(nèi)的HMGB1可釋放至細(xì)胞外,引起單核巨噬細(xì)胞分泌促炎因子,在感染性和非感染性炎癥疾病如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、胰腺炎、燙傷、動(dòng)脈粥樣硬化等的病理過程中起著重要作用[5]。研究表明,HMGB1位于核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)(NF-κB）上游,進(jìn)而推測(cè)在CRP 術(shù)后早期由受損、壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放的HMGB1 是啟動(dòng)CRP術(shù)后早期腦損傷的主要炎性因子,與急性顱腦損傷預(yù)后有一定的關(guān)系[6]。

S100A8/A9作為早期的炎癥標(biāo)志物,在抗感染、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等過程中都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。KATANO 等[7]發(fā)現(xiàn),S100A8/A9能夠在特定條件下刺激炎癥細(xì)胞釋放炎癥蛋白和炎癥介質(zhì)直接參與炎癥疾病過程。戴貴軍等[8]認(rèn)為,S100A8/A9激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH）氧化酶系統(tǒng),誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS）生成增加,誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡,具有對(duì)心血管事件高危人群的篩選價(jià)值。有研究表明,CA/CRP 激活先天免疫系統(tǒng)可能通過S100A8/A9 介導(dǎo)的急性炎癥激活小膠質(zhì)細(xì)胞、釋放炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,參與CA/CRP腦損傷的早期過程[4]。

研究發(fā)現(xiàn),在某些條件下,HMGB1也可以分泌到細(xì)胞外,并在炎癥、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用。WANG H 等[9]研究認(rèn)為,膿毒癥患者血清中HMGB1水平明顯升高,而HMGB1 水平高的患者死亡率高。YAMADA S 等[10]研究顯示,急性冠脈綜合征患者血清HMGB1水平明顯高于未發(fā)生心臟意外者。侯安然等[11]發(fā)現(xiàn)CRP術(shù)后大鼠海馬組織、血清HMGB1表達(dá)與病理學(xué)變化、大腦水腫程度變化趨勢(shì)高度一致。綜上所述,S100A8/A9和HMGB1可以作為有效的血清標(biāo)志物來預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后,對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義。

本研究檢測(cè)血清中S100A8/A9和HMGB1水平,并將其應(yīng)用于評(píng)估CA/CRP后缺血再灌注等造成的腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度及預(yù)后判斷。結(jié)果顯示,預(yù)后差組中患者血清中S100A8/A9和HMGB1的表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好組(P＜0.05）。表明二者可為心肺復(fù)蘇患者在臨床預(yù)后的初期評(píng)估中提供客觀實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。