楊世榮 陳艷琴 白翔宇 甘露 何顯力

結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)分別位居第三和第二位［1］。大多結(jié)直腸癌患者確診時已處于中晚期，患者預(yù)后差異較大。但目前結(jié)直腸癌發(fā)病及進展的機制尚不完全清楚，可用于預(yù)測患者預(yù)后的標(biāo)志物亦有限。線粒體是一種能量供應(yīng)的重要細胞器，參與ATP合成，可調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)，介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡和生物合成代謝等［2］。大量研究證實，線粒體功能異常幾乎在所有腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［3-6］。線粒體轉(zhuǎn)錄因子 B1（mitochondria transcription factor B1，TFB1M）是線粒體轉(zhuǎn)錄起始因子，在調(diào)控線粒體氧化磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，已被證實在多種實體腫瘤中表達異常［7-8］，但在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確。本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織中TFB1M的表達并利用癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫的結(jié)直腸癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床樣本信息，分析TFB1M表達與患者預(yù)后的相關(guān)性，同時在結(jié)直腸癌細胞中調(diào)控TFB1M的表達后觀察其對細胞增殖的影響，探討TFB1M與結(jié)直腸癌的關(guān)系，為結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測及治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人結(jié)直腸癌細胞株SW620和HCT116購自ATCC細胞庫。胎牛血清購自中國BBI Life Sciences公司，青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司，DMEM培養(yǎng)基購自中國瑞博公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司，蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，MTS檢測試劑盒購自美國 Promega公司，β-actin抗體和兔二抗購自中國北京天德悅公司，TFB1M抗體購自美國OriGene公司，攜帶TFB1M干涉、過表達質(zhì)粒的慢病毒購自中國上海吉瑪基因公司。

1.2 組織樣本來源

收集2015年1月至2019年1月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院手術(shù)治療的112例結(jié)直腸癌患者的臨床資料。所有患者術(shù)前均未經(jīng)任何抗腫瘤治療，其癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診，并由2位病理學(xué)醫(yī)師診斷及復(fù)核。所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，-80℃冰箱保存。本研究獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。中位隨訪時間為28個月，總生存期定義為手術(shù)日至患者死亡或末次隨訪的時間。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測TFB1M的表達

組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟后用檸檬酸鈉進行抗原高壓修復(fù)，山羊血清室溫封閉，滴加稀釋的TFB1M抗體（1∶800），4℃孵育過夜，兔二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對照。細胞染色強度評分：無染色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。細胞陽性率評分：0～9%計0分，10%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。陽性綜合評分為染色強度評分與陽性細胞率評分的乘積：≤3分為低表達，＞3分為高表達。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)分析

利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA（http：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/） 數(shù)據(jù)庫下載 575 例結(jié)直腸癌患者的mRNA表達二代測序數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。以基因表達中位值（5.8）分組，＞5.8為TFB1M高表達組，≤5.8為TFB1M低表達組。

1.5 細胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染

人結(jié)直腸癌細胞SW620和HCT116用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期細胞，以5×104/孔接種于6孔板，實驗分為4組：shCtrl組轉(zhuǎn)染陰性干涉質(zhì)粒慢病毒，shTFB1M組轉(zhuǎn)染TFB1M干涉質(zhì)粒慢病毒，EV組轉(zhuǎn)染含空載質(zhì)粒慢病毒，TFB1M組轉(zhuǎn)染含TFB1M過表達質(zhì)粒的慢病毒。待細胞貼壁后進行慢病毒轉(zhuǎn)染：960 μL無血清DMEM培養(yǎng)基+40 μL感染增強液+5 μL病毒原液（病毒濃度為1×108/mL），10 h后更換含血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，采用嘌呤霉素（濃度為5 ng/mL）進行病毒轉(zhuǎn)染抗性篩選。

1.6 Western blot檢測TFB1M的表達

RIPA裂解液裂解細胞后提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度并添加5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴10 min后上樣，10%聚丙烯酰胺分離凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉，添加一抗TFB1M（稀釋比例為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；二抗β-actin（稀釋比較為1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌液清洗，然后采用熒光成像進行定量檢測，Image J軟件分析條帶，以β-actin蛋白條帶灰度值為參照。

1.7 MTS法檢測細胞增殖能力

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW620和HCT116細胞，以2×103/孔細胞密度接種至96孔板，設(shè)5個復(fù)孔及陰性對照，待細胞貼壁后加入20 μL/孔MTS工作液，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。利用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度值，記錄為起始數(shù)據(jù)（0 h），同樣方法分別于 24 h，48 h，72 h，96 h再次檢測，根據(jù)記錄數(shù)據(jù)繪制細胞增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；采用Kaplan-Meier法計算生存率，兩組生存曲線比較采用Log-rank檢驗，Cox等比例風(fēng)險回歸模型分析TFB1M表達水平與總生存期的關(guān)系，計算風(fēng)險比（HR）及其對應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。shCtrl組和shTFB1M組細胞增殖能力的差異，采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFB1M在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，TFB1M主要染色于細胞質(zhì)，癌旁正常結(jié)腸上皮細胞大部分呈中至強染色，結(jié)直腸癌細胞呈部分弱染色。結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中TFB1M的陽性表達評分分別為（3.79±1.66）分和（8.14±1.82）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 1。

圖1 TFB1M在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達（SP×200）Fig.1 Expression of TFB1M in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×200）

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

TCGA公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示，TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中的表達較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低（P=0.010），而不同年齡、性別患者TFB1M表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。Kaplan-Meier生存分析顯示，TFB1M高表達患者和低表達患者的中位生存時間分別為99個月和79個月，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.038），見圖2。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer of TCGA

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer of TCGA

2.3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的單因素和多因素分析

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的單因素Cox模型分析結(jié)果顯示，TFB1M mRNA表達水平、年齡、TNM分期與結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期有關(guān)（P＜0.05），多因素Cox模型分析顯示，年齡、TNM分期和TFB1M mRNA表達水平是影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的獨立因素（P＜0.05），見表 2。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer of TCGA

2.4 基于臨床樣本分析TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

不同年齡、性別的結(jié)直腸癌患者TFB1M表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005），見表 3。Kaplan-Meier生存分析顯示，TFB1M高表達患者和低表達患者的中位生存時間分別為33個月和23個月，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008），見圖 3。

2.5 基于臨床樣本的單因素和多因素分析

單因素Cox模型分析發(fā)現(xiàn)，TFB1M蛋白表達水平（P=0.002）、年齡（P=0.005）和 TMN 分期（P＜0.001）與結(jié)直腸癌患者總生存期有關(guān)。多因素Cox模型分析顯示TFB1M表達水平是影響結(jié)直腸癌患者總生存期的獨立因素（P=0.029）。見表4。

2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞SW620和HCT116后TFB1M的表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，SW620細胞和HCT116細胞中，shTFB1M組TFB1M表達均較shCtrl組顯著降低（0.32±0.03 vs 0.93±0.12，P＜0.001；0.17±0.05 vs 0.56±0.11，P＜0.001），而 TFB1M 組 TFB1M 的表達均顯著高于 EV 組（1.49±0.19 vs 0.94±0.08，P＜0.001；1.63±0.08 vs 0.62±0.06，P＜0.001），見圖4。說明TFB1M干涉和過表達結(jié)直腸癌細胞SW620和HCT116構(gòu)建成功。

2.7 干涉/過表達TFB1M對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響

MTS實驗檢測結(jié)果顯示，SW620細胞和HCT116細胞中，shTFB1M組的細胞增殖能力均較shCtrl組顯著增強（F=80.6，P＜0.001；F=532.6，P＜0.001），而 TFB1M組細胞增殖能力均較EV組下降（F=130.2，P＜0.001；F=55.0，P=0.002），見圖 5。

圖3 TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer

表3 TFB1M表達與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系Tab.3 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer

表4 影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素分析Tab.4 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer

圖4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后SW620和HCT116細胞中TFB1M蛋白的表達Fig.4 Expression of TFB1M in SW620 and HCT116 cells after lentivirus transfection were detected by Western blot

圖5 MTS法檢測干涉/過表達TFB1M后結(jié)直腸癌細胞SW620和HCT116的增殖能力Fig.5 The proliferation of SW620 and HCT116 cells after interference/overexpression of TFB1M detected by MTS

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜過程［9］。結(jié)直腸癌進展過程中，細胞能量代謝變化和活性氧等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著重要調(diào)控作用［10］。線粒體是細胞重要的能量代謝樞紐，也是活性氧和活性氮的重要來源，在腫瘤進展各個階段可通過代謝重編程、分裂融合、氧化還原穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激信號傳導(dǎo)等方式影響腫瘤細胞生長和生存。線粒體DNA（mtDNA）具有獨立的環(huán)狀雙鏈DNA，由線粒體RNA聚合酶（mtRNAP）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A（TFAM）、TFB1M、線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2（TFB2M）組成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可參與mtDNA上各種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而影響線粒體功能發(fā)揮［8］。TFB1M作為轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的重要組成部分，其表達異常可直接影響細胞線粒體的功能發(fā)揮［11］。研究發(fā)現(xiàn)與TFB1M功能相似的其他線粒體轉(zhuǎn)錄因子，如TFAM 在腎細胞癌［12］和肺癌［13］等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸癌中，TFAM的雜合性缺失可導(dǎo)致腸上皮細胞線粒體功能異常、活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，進而促進小鼠腸道自發(fā)成瘤［14］。同樣在微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)直腸癌中，TFAM框移突變也可通過降低mtDNA拷貝數(shù)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞對順鉑等化療藥物抵抗［15］。以上研究提示線粒體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在惡性腫瘤發(fā)生進展中發(fā)揮著重要作用。

本研究收集結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除樣本及臨床資料，免疫組織化學(xué)法檢測證實TFB1M在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，結(jié)合TCGA公共數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌組織表達譜數(shù)據(jù)和臨床樣本信息分析TFB1M與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)中TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達均較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低，且TFB1M低表達患者術(shù)后總生存期顯著低于高表達患者，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)TFB1M是影響患者總生存的獨立因素，說明TFB1M可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生，且TFB1M低表達患者預(yù)后不良。本研究進一步在細胞水平研究TFB1M與結(jié)直腸癌的關(guān)系，通過慢病毒轉(zhuǎn)染法分別在結(jié)直腸癌SW620和HCT116細胞中干涉和過表達TFB1M，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干涉TFB1M可顯著促進結(jié)直腸癌SW620和HCT116細胞的增殖能力，而過表達TFB1M則抑制其增殖能力，初步證實TFB1M表達異常可能通過影響線粒體功能而對結(jié)直腸癌細胞增殖發(fā)揮調(diào)控作用。既往有研究報道TFB1M缺失可導(dǎo)致細胞線粒體功能異常，進而引起活性氧蓄積［16］。而ROS與腫瘤發(fā)生進展密切相關(guān)，可引起細胞中包括DNA在內(nèi)的大分子損傷，是體內(nèi)誘導(dǎo)細胞癌變的重要危險因素［17-18］。TFB1M在結(jié)直腸癌中表達降低是否通過引起ROS蓄積，進而促進抑癌基因突變和促癌基因活化導(dǎo)致細胞增殖能力增強仍有待進一步探討。

本研究通過公共數(shù)據(jù)分析和臨床樣本驗證，以及體外細胞實驗證實TFB1M在結(jié)直腸癌中低表達，且低表達者預(yù)后較差，干涉TFB1M可促進結(jié)直腸癌細胞增殖，TFB1M可能是結(jié)直腸癌潛在的預(yù)后評估標(biāo)志物和治療靶點。但本研究納入臨床樣本量有限，TFB1M在結(jié)直腸癌中表達異常及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，以及在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍需擴大臨床樣本量及動物模型進一步研究。