徐桂娜 何雪梅 周曉蓉 曾凡勝 秦志強(qiáng)

血吸蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害群眾身體健康，阻礙經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的寄生蟲(chóng)病[1]。隨著我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治工作的不斷深入，當(dāng)前我國(guó)血吸蟲(chóng)病已呈低度流行態(tài)勢(shì)[2]。但目前經(jīng)典沿用的診斷方法都存在不同程度的缺陷，越來(lái)越難以滿足當(dāng)前防治的需求[3]。因此，現(xiàn)階段迫切需要建立與發(fā)展精準(zhǔn)的檢測(cè)方法用于我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治[4]。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)18～30 nt高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA(small RNA，smRNA)分子[5]，通過(guò)結(jié)合互補(bǔ)mRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖與凋亡、新陳代謝等多種生命活動(dòng)[6]。miRNA在血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、寄生及致病機(jī)制中可能具有重要作用[7]。因此，對(duì)miRNA在日本血吸蟲(chóng)病中的深入研究可為藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、疫苗研制及診斷開(kāi)辟新的思路。近年來(lái)，圍繞血吸蟲(chóng)miRNA的鑒定、靶基因識(shí)別及診斷展開(kāi)了較多研究。目前研究miRNA表達(dá)的主要方法有Real-Time PCR、miRNA芯片以及第二代測(cè)序[8]。本文通過(guò)構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵分泌物(egg secreted product, ESP)的小RNA文庫(kù)，應(yīng)用Illumina NextSeq 500第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，再結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，快速鑒定保守的miRNA，篩選出差異表達(dá)的miRNA，為下一步驗(yàn)證血吸蟲(chóng)感染患者血液中的miRNA靶標(biāo)并為發(fā)展基于miRNA的分子診斷方法奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、日本血吸蟲(chóng)ESP制備

參照朱蓉[9]等報(bào)道的方法制備日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵。新鮮的日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵用0.9%生理鹽水和RPMI1640培養(yǎng)基分別漂洗3次，用RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后，吸取培養(yǎng)上清，1200×g、4℃離心10 min，收集上清，即為蟲(chóng)卵分泌物(ESP)，蟲(chóng)卵ESP用0.45 μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、ESP總RNA制備

使用Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))提取日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵ESP總RNA，利用日本Takara提供的專用試劑37℃孵育30 min以清除殘留的基因組DNA，使Oligotex mRNA MidiKit(Qiagen，德國(guó))分離純化樣品mRNA。RNA的質(zhì)量和含量通過(guò)使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Nanodrop ND-1000，LabTech，美國(guó))檢測(cè)吸光度260 nm/280 nm(A260/A280)進(jìn)行測(cè)定，完整性通過(guò)1.5%(w/v)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

三、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和RNA高通量測(cè)序

按照小RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程對(duì)純化后的日本血吸蟲(chóng)ESP總RNA進(jìn)行3′端接頭連接，5′端接頭連接、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，cDNA文庫(kù)大小選擇，純化等步驟，完成測(cè)序樣本文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)利用熒光染料法(Picogreen)和熒光光度計(jì)方法定量文庫(kù)，并用Agilent 2100 Bioanalyzer(美國(guó))和ABI StepOnePlus Real Time PCR System(美國(guó))進(jìn)行質(zhì)檢，將每個(gè)質(zhì)檢檢測(cè)合格的樣品稀釋至終濃度10 nmol/L后，交由上海派森諾生物技術(shù)有限公司，使Illumina NextSeq 500測(cè)序儀(美國(guó))進(jìn)行測(cè)序。

四、原始數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)過(guò)濾及長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用質(zhì)控工具fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭序列以及低質(zhì)量序列(包括模糊堿基N，堿基質(zhì)量小于20以及長(zhǎng)度小于18 nt的序列)，得到可供后續(xù)分析的序列，并進(jìn)行處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)及長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。

五、比對(duì)注釋，鑒定已知miRNA

應(yīng)用CLC genomics_workbench 5.5商業(yè)軟件將預(yù)處理后的序列與最新Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，比對(duì)過(guò)程不允許有堿基錯(cuò)配。另與其他非編碼數(shù)據(jù)庫(kù)ncRNA、piRNA和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，允許與目標(biāo)序列有2個(gè)堿基錯(cuò)配、允許比目標(biāo)序列兩端各縮短或延長(zhǎng)2個(gè)堿基。

六、miRNA表達(dá)水平

采用DEGseqR語(yǔ)言包結(jié)合perl腳本將ESP按照分組情況進(jìn)行miRNA表達(dá)量的比較分析。使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值(Transcripts per million,TPM)進(jìn)行差異分析。

結(jié) 果

一、總RNA提取質(zhì)量評(píng)估

RNA的質(zhì)量和含量通過(guò)使用Nanodrop ND1000(LabTech，美國(guó))檢測(cè)，吸光度260 nm/280 nm(A260/A280)的值為2.33，完整性通過(guò)1.5%(w/v)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，RNA完整性計(jì)數(shù)RIN(RNA Integrity Number)為2.4(見(jiàn)圖1)。

圖1 總RNA提取質(zhì)量分析

二、原始數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)過(guò)濾

本研究利用IlluminaNextSeq 500測(cè)序平臺(tái)對(duì)血吸蟲(chóng)ESP進(jìn)行測(cè)序分析獲得原始閱讀序列讀數(shù)(Raw Reads)為23 348 390條。應(yīng)用fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)對(duì)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵ESP測(cè)序，原始序列數(shù)(reads)進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭序列以及低質(zhì)量序列(包括模糊堿基N，堿基質(zhì)量小于20以及長(zhǎng)度小于18 nt的序列)，最終獲得ESP過(guò)濾后的序列讀數(shù)為13 190 761條。去掉重復(fù)序列前ESP序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)在30 nt處出現(xiàn)最高峰；去重后ESP序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)主要分布在26～30 nt處(見(jiàn)圖2)。

橫軸為不同的序列長(zhǎng)度，縱軸為對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的序列豐度(*10000)

三、比對(duì)注釋及miRNA表達(dá)

將測(cè)序所得小 RNAs序列進(jìn)行比對(duì)注釋，其中有注釋的小 RNA為84 735條，約占12.6%。將構(gòu)建文庫(kù)中樣品表達(dá)的miRNA與最新Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的miRNA比對(duì)，ESP文庫(kù)中有270條序列可與日本血吸蟲(chóng)的miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上，已知的成熟miRNA有12個(gè)，未發(fā)現(xiàn)有新miRNA。miRNA表達(dá)量分析顯示sja-miR-3488為表達(dá)量最高的miRNA，sja-miR-36-3p和sja-miR-71a表達(dá)量也較高，3種miRNA表達(dá)量占91.8%(見(jiàn)表1)。

表1 miRNA表達(dá)定量分析

討 論

miRNA在哺乳動(dòng)物血漿、血清、尿液等體液中穩(wěn)定存在[10，11]，近年來(lái)已相繼發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可作癌癥的生物標(biāo)志物，是研究者高度關(guān)注的新診斷靶點(diǎn)[12～14]。miRNA亦用于診斷多種其他感染性疾病的生物標(biāo)志物，比如肺結(jié)核[15，16]、膿毒病[17，18]、病毒性肝炎[19，20]等。近年來(lái)，人們?cè)谘x(chóng)感染宿主的血液[21，22]、糞便[23，24]中檢測(cè)出了血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體、蟲(chóng)卵來(lái)源的循環(huán)DNA，為血吸蟲(chóng)病的核酸診斷研究開(kāi)辟了新的途徑。miRNA在日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵和蟲(chóng)體有特異性表達(dá)[25]，有可能成為特定生物標(biāo)志物。日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵sja-miR-71b-5p、sja-miR-71、sja-miR-36-3p高表達(dá)[25]，sja-miR-125b在成蟲(chóng)呈顯著表達(dá)[26]，提示上述miRNAs分別具有作為蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)階段特異標(biāo)志物的潛力。Hoy等[27]在感染曼氏血吸蟲(chóng)小鼠血清中鑒別出宿主源性和寄生蟲(chóng)源性的miRNA，并在感染患者血清中檢測(cè)出的三種寄生蟲(chóng)源性miRNAs，即miR-277、miR-3479-3p和miR-bantam，上述三種miRNAs可作為血吸蟲(chóng)感染的新標(biāo)志物。Cai等[28]發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)源性的特異循環(huán)miRNAs sja-miR-277和sja-miR-3479-3p是診斷日本血吸蟲(chóng)病的潛力靶標(biāo)。以上研究顯示血吸蟲(chóng)病患者血清或血漿中出現(xiàn)特異的miRNA，且具有穩(wěn)定性高、結(jié)合靈敏度高和檢測(cè)特異的特點(diǎn)。蟲(chóng)卵作為主要致病因素可促使血吸蟲(chóng)感染的發(fā)生，并且逃避或操縱宿主免疫反應(yīng)，因此對(duì)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵ESP miRNA的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)目標(biāo)[25，29]。為鑒定日本血吸蟲(chóng)ESP miRNAs，本研究基于Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)日本血吸蟲(chóng)ESP miRNA進(jìn)行了測(cè)定，獲得了13 190 761個(gè)可用的過(guò)濾后的序列數(shù)，經(jīng)過(guò)對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)注釋，獲得12個(gè)已知miRNAs，未發(fā)現(xiàn)有新miRNA，其中sja-miR-3488表達(dá)量最高，sja-miR-36-3p和sja-miR-71a表達(dá)量也較高，這三種miRNAs表達(dá)量占91.8%。而血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵中sja-miR-71b-65p、sja-miR-71、sja-miR-1、sja-miR-36-3P、sja-miR-124-3p表達(dá)最高，占86%，說(shuō)明特定miRNA家族在寄生蟲(chóng)的不同發(fā)育階段都有特征性的偏倚表達(dá)[25]。sja-miR-36-3p在血吸蟲(chóng)胚胎發(fā)育中起重要作用，同時(shí)也可調(diào)節(jié)血吸蟲(chóng)尾蚴和肺期童蟲(chóng)發(fā)育；sja-miR-71家族成員在蟲(chóng)卵階段發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25]。

綜上，通過(guò)對(duì)血吸蟲(chóng)ESP中miRNAs的鑒定，尤其是sja-miR-3488、sja-miR-36-3p和sja- miR-71a可能在血吸蟲(chóng)病蟲(chóng)卵致病過(guò)程中具有重要作用，它們是否存在于血吸蟲(chóng)感染宿主血清中，值得進(jìn)一步驗(yàn)證和闡明其功能以尋找新的血吸蟲(chóng)病診斷標(biāo)志物。