張?jiān)孪? 張立營(yíng) 趙權(quán)

[摘要]流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種基于單顆粒的高通量、高內(nèi)涵檢測(cè)的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和臨床診斷，誕生至今已有52年的歷史。近年來(lái)，流式細(xì)胞儀在液路、光路和信號(hào)轉(zhuǎn)化、數(shù)據(jù)采集、計(jì)算等方面發(fā)展迅速，為個(gè)性化醫(yī)療背景下的血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等提供單細(xì)胞水平更快、更精、更廣的組學(xué)信息。目前我國(guó)FCM應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在免疫學(xué)、血液學(xué)、臨床腫瘤學(xué)和造血干細(xì)胞移植應(yīng)用等領(lǐng)域，本文總結(jié)了FCM的醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀與前景。

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞術(shù);個(gè)性化醫(yī)療;醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀;前景

[中圖分類號(hào)] R733.71 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2019）12（a）-0028-03

Current status and prospects of medical application of flow cytometry

ZHANG Yue-xia1 ? ZHANG Li-ying1 ? ZHAO Quan2

1. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao Special Service Center， Shandong Province， Qingdao ? 266071， China; 2. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao 971 Hospital， Shandong Province， Qingdao ? 266071， China

[Abstract] Flow cytometry （FCM） is a high throughput and intensive detection technique based on single particle， which has been widely used in life science and clinical diagnosis for 52 years. In recent years， flow cytometer has developed rapidly in liquid， light and signal transformation， data acquisition， calculation， etc. In the context of personalized medical treatment， it provides faster， more precise and broader histological information for hematology， immunology， oncology， etc. At present， the application of FCM in China mainly focuses on immunology， hematology， clinical oncology and hematopoietic stem cell transplantation. This paper summarizes the current status and prospects of medical application of FCM.

[Key words] Flow cytometry; Personalized medical treatment; Medical application status; Prospects

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種生物技術(shù)，根據(jù)生物技術(shù)學(xué)科（例如計(jì)算機(jī)、流體力學(xué)和電子學(xué)），通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)懸浮液中的單細(xì)胞或其他生物顆粒，其能夠在應(yīng)用中具體分析細(xì)胞，包括細(xì)胞功能，特性等，是一種實(shí)現(xiàn)高速、一對(duì)一的細(xì)胞定量和分選技術(shù)[1-2]。FCM目前被廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域。

目前，中國(guó)的FCM應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在以下幾個(gè)方面，①免疫學(xué)領(lǐng)域：FCM被用于評(píng)估人體的免疫功能狀況，可以被輔助診斷諸如獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）等免疫系統(tǒng)疾病。②血液學(xué)領(lǐng)域：FCM被用來(lái)對(duì)血液系統(tǒng)疾病的免疫分型和對(duì)白血病最小殘留病變（MRD）進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，通常被用來(lái)進(jìn)行血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療評(píng)估和可能的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。FCM的細(xì)胞免疫表型鑒定在診斷造血系統(tǒng)疾病時(shí)具有重大的意義，是最重要的國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)之一，目前已被廣泛接受并被認(rèn)為是一種免疫表型鑒定方法。③臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域：FCM可以了解DNA倍性和進(jìn)行細(xì)胞周期分析，DNA異常倍性的出現(xiàn)意味著DNA合成異?；蛘吆铣烧系K，這可能是腫瘤或癌前病變的重要標(biāo)志之一。④造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域：在器官移植領(lǐng)域，足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞對(duì)成功進(jìn)行造血干細(xì)胞移植非常重要，同時(shí)FCM還具有鑒定和計(jì)數(shù)造血的功能[3]。

1 FCM及流式細(xì)胞儀

1.1 FCM

是用流式細(xì)胞儀測(cè)量液相中懸浮細(xì)胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)，它是眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科技領(lǐng)域相結(jié)合的高科技結(jié)晶。FCM的主要方法是利用對(duì)流細(xì)胞術(shù)在懸浮細(xì)胞中的應(yīng)用，根據(jù)生物技術(shù)學(xué)科（例如計(jì)算機(jī)、流體力學(xué)和電子學(xué)）中的應(yīng)用知識(shí)進(jìn)行測(cè)量，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特定分析，包括細(xì)胞功能和特性。近年來(lái)，隨著FCM的發(fā)展和進(jìn)步，它在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用已逐漸得到擴(kuò)展，包括細(xì)胞生物測(cè)定、免疫功能分析、臨床腫瘤檢測(cè)、病理學(xué)分析、血液檢測(cè)等[4-5]。

1.2流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀的主要組成部分是：①流動(dòng)室和液流系統(tǒng);②激光源和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng);③光電管和檢測(cè)系統(tǒng);④信號(hào)處理系統(tǒng)和信號(hào)分析系統(tǒng);⑤細(xì)胞進(jìn)行分類和篩選系統(tǒng)。

流式細(xì)胞儀的基本工作原理是：先通過(guò)激光測(cè)量鞘液中的染色細(xì)胞標(biāo)志物，然后記錄熒光強(qiáng)度、熒光寬度及散射光強(qiáng)度等參數(shù)。此外，根據(jù)熒光標(biāo)記的被檢測(cè)物質(zhì)的單克隆抗體的類型不同，對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行分析。

2 FCM的醫(yī)學(xué)應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 FCM在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

利用核酸染料觀察核型和細(xì)胞分裂是流式技術(shù)的最早應(yīng)用之一。FCM通過(guò)檢測(cè)插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基對(duì)的核酸熒光染料被激發(fā)后的熒光強(qiáng)度得以實(shí)現(xiàn)。通過(guò)分支DNA雜交探針技術(shù)檢測(cè)單細(xì)胞水平特異性mRNA，可以為研究和診斷提供準(zhǔn)確可追溯的細(xì)胞信息[6-7]，從而了解病變情況。

2.2 FCM在液相活檢中的應(yīng)用

BEAMing技術(shù)結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)，其方法是每一類DNA分子都會(huì)專一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記來(lái)做出評(píng)估。這種方法是基于小珠（bead）、乳濁液（emulsion）、擴(kuò)增（amplification）、磁性（magnetic）這四個(gè)主要組分來(lái)構(gòu)建的，所以被稱作為BEAMing。在液體活檢中進(jìn)行FCM，為低豐度基因如腫瘤來(lái)源的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、KRAS等基因以及Septin9基因甲基化的絕對(duì)定量檢測(cè)提供了幫助，BEAMing技術(shù)正為針對(duì)癌癥患者的靶向篩查、耐藥性監(jiān)測(cè)提供非侵入性的檢測(cè)保障[8-9]。

2.3成像流式細(xì)胞儀

成像流式細(xì)胞儀整合了FCM和熒光顯微鏡成像技術(shù)，基于單細(xì)胞圖像，獲得有關(guān)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞空間定位以及信號(hào)強(qiáng)度定量的完整信息[10-11]。既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提供了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布更直觀、準(zhǔn)確的細(xì)胞水平完整信息。

2.4微流式細(xì)胞術(shù)

微流式細(xì)胞術(shù)是芯片實(shí)驗(yàn)室的典范，具有便攜式、價(jià)格便宜、易于操作等特點(diǎn)，可以滿足軍事和疫區(qū)的快速檢測(cè)需求。而且，通過(guò)結(jié)合磁性微球可以分離并計(jì)數(shù)細(xì)胞。乳化液滴PCR和熒光標(biāo)記的Taqman探針用于擴(kuò)增觀察對(duì)象的基因，以實(shí)現(xiàn)分選。細(xì)胞變形能力、拉曼全光譜和其他平臺(tái)用于細(xì)胞分選和準(zhǔn)確分析[12-13]。

2.5體內(nèi)流式細(xì)胞儀

體內(nèi)流式細(xì)胞儀使用可穿戴設(shè)備通過(guò)光聲、光熱、拉曼光譜、高速透射電子顯微鏡、多光子共聚焦成像等方法獲得異常的血管內(nèi)細(xì)胞，或用于非侵入性動(dòng)態(tài)觀察分析的稀有細(xì)胞[14-15]。

2.6光譜流式細(xì)胞儀

光譜流式細(xì)胞儀的光路使用光柵代替二向色鏡或全光譜棱鏡。使用更靈敏的接收器[例如電荷耦合器件（CCD）]來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的光電倍增管（PMT）接收器。光譜流式細(xì)胞儀可以識(shí)別每個(gè)光譜信號(hào)的獨(dú)特形狀，而不是傳統(tǒng)的發(fā)射峰，終光譜信號(hào)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行解析判斷。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）是光譜FCM的特定應(yīng)用之一[16-17]。

2.7質(zhì)譜流式細(xì)胞儀

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀是一種使用質(zhì)譜儀對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的流動(dòng)技術(shù)。它不僅繼承了傳統(tǒng)FCM高速分析的特點(diǎn)，并且具有高分辨率的質(zhì)譜分析能力。這是FCM的新發(fā)展方向。它是近年來(lái)出現(xiàn)的一種單細(xì)胞分析技術(shù)。首先用背景極低的金屬標(biāo)記物標(biāo)記樣品，單細(xì)胞水平觀察是通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和FCM進(jìn)行[18-19]。通過(guò)可視化和大數(shù)據(jù)計(jì)算，質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)在免疫表型、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析和細(xì)胞亞群進(jìn)化等方面具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。

2.8 FCM在白血病診斷和治療監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

白血病屬于一種血液系統(tǒng)疾病。在各種急性白血病的診斷和鑒定中，一般形態(tài)學(xué)檢查難以有效區(qū)分不同類型的白血病，現(xiàn)今的FCM在白血病的診斷和治療監(jiān)測(cè)中起著關(guān)鍵作用。就白血病免疫表型而言，目前通常使用FCM CD45/SSC兩參數(shù)散射網(wǎng)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行分型鑒定。這種方法可以清楚地將骨髓造血細(xì)胞分為粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、未成熟細(xì)胞和有核紅細(xì)胞群體，F(xiàn)CM能有效排除正常細(xì)胞對(duì)白血病免疫分型的干擾[20-22]。

2.9 FCM在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用

FCM通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中DNA含量的變化來(lái)檢測(cè)實(shí)體瘤。因此，F(xiàn)CM技術(shù)一直被認(rèn)為是病理形態(tài)學(xué)診斷中腫瘤診斷的重要方面。①FCM可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA倍體進(jìn)行分類，來(lái)鑒定腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性;②FCM可以通過(guò)分析腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖活性、凋亡水平和細(xì)胞分化，探索腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的特征;③FCM可以對(duì)癌基因（ras基因家族、p21、bcl-2、cerbB-2、myc基因家族），抑癌基因（p53、RB、p16等），與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（CD44S、CD44V5、CD44V6、Nm23等），凋亡相關(guān)基因（caspases-3，膜聯(lián)蛋白V、Survivin、CD95和腫瘤相關(guān)抗原細(xì)胞角蛋白）進(jìn)行檢測(cè)和分析，可以用于研究腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)特征，從而為腫瘤的治療提供參數(shù);④FCM可以對(duì)腫瘤患者的淋巴細(xì)胞及其亞群、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子等進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而可以探索腫瘤患者的免疫特征。

綜上所述，通過(guò)FCM檢測(cè)和分析腫瘤及相關(guān)細(xì)胞的各種參數(shù)，可以進(jìn)一步提高腫瘤診斷研究水平[23-25]。

3 FCM的前景與思考

FCM在國(guó)外已有十多年的歷史，在中國(guó)的應(yīng)用發(fā)展時(shí)間還很短，仍然存在很多不足。從FCM的誕生開(kāi)始，F(xiàn)CM的應(yīng)用幾乎涵蓋了整個(gè)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域[26-30]。流式細(xì)胞儀是高端精密儀器，要求使用者掌握和具備免疫學(xué)、血液學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科的知識(shí)和技術(shù)，且儀器價(jià)格昂貴，這些因素阻礙了FCM在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用和普及。另外，國(guó)內(nèi)FCM設(shè)備和試劑主要依靠進(jìn)口，導(dǎo)致我國(guó)FCM的臨床應(yīng)用相對(duì)緩慢。然而，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)流式行業(yè)已經(jīng)推出了民族品牌并獲得了臨床認(rèn)可。FCM與大數(shù)據(jù)和個(gè)性化醫(yī)療的需求高度兼容，必將為人類健康提供更準(zhǔn)確的服務(wù)。

綜上所述，我國(guó)的FCM在臨床和科學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并且在儀器儀表和技術(shù)上取得了一些進(jìn)展，但也應(yīng)該明確認(rèn)識(shí)到，F(xiàn)CM的技術(shù)發(fā)展和臨床應(yīng)用仍需改進(jìn)。

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（收稿日期：2019-04-15 ?本文編輯：孟慶卿）