張巖 鄧?yán)枥?張壯苗 顏榕辛

（三亞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 三亞572000）

肝癌是老年患者中最常見惡性腫瘤，也是我國(guó)發(fā)病率最高、危害最大惡性腫瘤之一［1－2］。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)和生活方式改變，肝癌發(fā)病率和死亡率有逐年升高趨勢(shì)。關(guān)于肝癌發(fā)病機(jī)理尚不明確，已有證據(jù)顯示其可能與肝炎病毒感染、家族遺傳、過(guò)度飲酒、肝硬化等因素相關(guān)［3］。肝癌患者早期并無(wú)典型臨床癥狀，因此診斷時(shí)患者通常處于中晚期。目前臨床上尚無(wú)特效肝癌治療手段，患者預(yù)后較差。因此，探索肝癌發(fā)病相關(guān)生物大分子標(biāo)志物，加強(qiáng)早期診斷準(zhǔn)確性對(duì)臨床實(shí)踐具有重要價(jià)值。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是胎兒肝臟中合成糖蛋白，但成年人體內(nèi)含量通常下降到極低水平［4］；甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP－L3）、高爾基體跨膜蛋白73（GP73）和異常凝血酶原（DCP）也是體內(nèi)與多種惡性腫瘤病理過(guò)程相關(guān)生物大分子［5－6］，但是目前尚未見到其與老年肝癌患者發(fā)病及預(yù)后相關(guān)性報(bào)道。本研究對(duì)AFP、AFP－L3，GP73及DCP 蛋白在老年肝癌患者中表達(dá)及其與預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行研究，為臨床治療提供參考。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨 床 資 料 對(duì) 本 院2011 年01 月 至2016 年12月期間診治老年肝癌患者進(jìn)行研究。60例患者中男38例，女22例，年齡57～69歲，平均（64.6±6．7）歲。所有患者均符合中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)頒布《肝癌規(guī)范化診療2011版》中關(guān)于肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)。以本院同期老年肝硬化患者（n＝60）為對(duì)照。各組研究對(duì)象在平均年齡、性別比例等一般資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心腎功能異常患者；嚴(yán)重代謝功能障礙患者；嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙患者；高血壓患者；嚴(yán)重糖尿病患者。所有患者均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 AFP 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam 公司；AFP－L3蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；DCP蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R＆D 公司；GP73蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Elabsciences公司；二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司；低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司；低溫冰箱購(gòu)自三菱集團(tuán)；移液器購(gòu)自賽多利斯公司；槍頭購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法 腫瘤組織取出后立即用福爾馬林固定，待用。石蠟固定后進(jìn)行5μm 組織切片，分析不同組織中AFP 及AFP－L3定位及表達(dá)。5μm 石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）后 將 切 片置 于 枸 櫞酸三鈉：枸櫞酸＝3∶4溶液中用微波進(jìn)行修復(fù)（設(shè)置中高火，時(shí)間8min），3%雙氧水－甲醇溶液處理切片15min進(jìn)行封閉滅活酶，加一抗（1∶250）37 ℃，濕盒孵育2小時(shí)，加HRP標(biāo)記二抗（1∶250）孵育1 h，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，封片，光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 抽取各組研究對(duì)象清晨空腹靜脈血后1 000轉(zhuǎn)／min低速離心，分離上層血清，－80 ℃保存待用。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔，每個(gè)孔中加入樣本稀釋液100μL，第一個(gè)孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，混勻后用加樣器取出100μL 移至第二孔，重復(fù)操作至第7孔，最后從第7孔中吸出100μL丟棄，使其最終體積為100μL；加樣：待測(cè)樣本孔每個(gè)孔加入待測(cè)樣本100μL；將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃2h；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，倒置于濾紙上印干；每個(gè)孔中加入第一抗體工作液50μL；將反應(yīng)板置于37 ℃條件下60min；洗板；每個(gè)孔中加入酶標(biāo)抗體工作液100μL；將反應(yīng)板置于37 ℃條件下60min；洗板；每個(gè)孔中加入底物工作液100μL，置于37 ℃暗處條件下反應(yīng)5～10min；每個(gè)孔加入終止液50μL；在450nm 處測(cè)定各孔光吸收值，計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.5 回訪 根據(jù)患者臨床資料以電話形式對(duì)所有老年肝癌組患者進(jìn)行回訪，生存期以患者接受首次治療時(shí)間為起點(diǎn)，計(jì)算單位為月，截止日期為2017年1月，截尾值為到截止日期存活患者。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19．0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用（±s）表示，多樣本比較用單因素方差分析，用Kaplan－Meier分析AFP、AFPL3、DCP和GP73與生存期之間相關(guān)性，Long－rank法篩選對(duì)肝癌預(yù)后有影響因素，并繪制Kaplan－Meier曲線。P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表達(dá)分析 研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中AFP 及AFP－L3蛋白表達(dá)明顯升高，且差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見表1。

表1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表達(dá)分析

2.2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表達(dá)分析 研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中GP73及DCP 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

表2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表達(dá)分析

2.3 AFP、AFP－L3蛋白在肝癌組織中定位及表達(dá)分析 免疫組織化學(xué)檢測(cè)AFP、AFP－L3蛋白在肝癌組織中定位及表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組織中AFP 及AFPL3蛋白表達(dá)（棕色部分）明顯升高。見圖1。

2.4 AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性分析 在對(duì)AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著AFP、AFP－L3蛋白表達(dá)升高，患者預(yù)后逐漸變差。見圖2。

圖2 AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

2.5 DCP和GP73與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性分析 在對(duì)DCP 和GP73與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著DCP 和GP73蛋白表達(dá)升高，患者預(yù)后逐漸變差，見圖3。

圖3 DCP和GP73與老年肝癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

3 討 論

惡性腫瘤已成為威脅老年人健康重要疾病，老年病人多臟器功能差、合并癥多，并發(fā)惡性腫瘤后多預(yù)后差，死亡率高。如何能在老年人當(dāng)中早期篩查出惡性腫瘤，并對(duì)早期患者進(jìn)行早期干預(yù)和治療，從而達(dá)到提高療效，延長(zhǎng)生存期目，乃是我們目前迫在眉睫需要解決問(wèn)題。本研究通過(guò)拿老年肝硬化組和老年肝癌組做對(duì)照，分析肝癌發(fā)病相關(guān)腫瘤標(biāo)記物AFP、AFP－L3、GP73和DCP 蛋白在兩組患者中表達(dá)及其與預(yù)后相關(guān)性研究，以望能對(duì)臨床老年肝癌早期診斷和治療提供指導(dǎo)意義。

AFP其在胚胎時(shí)期由胎肝合成，出生后血清中AFP含量即顯著下降，一年內(nèi)達(dá)到正常成人水平（＜20ng／mL），而在PHC 發(fā)生時(shí)則又會(huì)急劇上升，是目前公認(rèn)最好肝癌臨床檢查指標(biāo)。甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP－L3）是PHC患者血清中AFP主要形式。AFP－L3因包含α1－6巖藻糖殘基，連接N－乙酰葡萄糖胺還原端后與LCA（扁豆凝集素）緊密結(jié)合，僅由肝癌細(xì)胞產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中AFP、AFP－L3蛋白表達(dá)明顯升高，且差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1），王軍海等［7］研究中也有相似發(fā)現(xiàn)，同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)AFP－L3與腫瘤大小密切相關(guān)。通過(guò)免疫組織化學(xué)，在肝癌組織中確實(shí)可以定位到AFP、AFP－L3蛋白表達(dá)，且其表達(dá)量要顯著高于對(duì)照組老年肝硬化組患者。

GP73是感染病毒后肝細(xì)胞內(nèi)具有正調(diào)節(jié)作用固有高爾基蛋白。GP73 主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，無(wú)論何種原因引起肝病，患者GP73水平均顯著上調(diào)，而所有肝病患者中肝癌患者GP73 水平最高［8］。本研究中，老年肝癌患者組血清中GP73 蛋白表達(dá)較對(duì)照組老年肝硬化組患者明顯升高。王文鼎等［9］研究中比較了肝癌、肝硬化和健康人體內(nèi)血清GP73水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中GP73 高達(dá)（201.9±92.9）μg／L 顯著高于肝硬化患者（76．4±25.5）μg／L 和正常人（29．9±15．0）μg／L。DCP 是一種由于維生素K 缺乏或Ⅱ型拮抗所產(chǎn)生異常蛋白，其氨基末端缺乏Y 一氨基谷氨酸，因而無(wú)法像正常凝血酶原一樣與鈣離子結(jié)合［10］。老年肝癌患者組血清中GP73及DCP 蛋白表達(dá)較對(duì)照組老年肝硬化組患者明顯升高。有研究者認(rèn)為肝癌患者血清中DCP過(guò)表達(dá)可能機(jī)制是肝癌細(xì)胞微粒體內(nèi)維生素K 依賴羧化體系功能障礙，羧化酶活力下降，導(dǎo)致羧化不全，從而形成大量DCP，DCP 對(duì)PHC有較高特異性，各種非癌性肝病，繼發(fā)性肝癌及良性肝臟腫瘤假陽(yáng)性極低［11］。GP73 和DCP 在多種惡性腫瘤組織內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，且與多種惡性腫瘤病理過(guò)程密切相關(guān)，對(duì)其研究可以有利于發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)病機(jī)制，早診斷早干預(yù)［12－13］。

以往研究還發(fā)現(xiàn)血清GP73和AFP 等十項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷HBsAg陽(yáng)性肝癌具有較好準(zhǔn)確性［14］，且腫瘤標(biāo)志物DCP 和AFP 在原發(fā)性肝癌 診斷中具有重要價(jià)值［15］。李慧等［16］也發(fā)現(xiàn)GP73聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)AFP 陰性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床診斷參考意義重大，且肝癌患者血清中GP73與腫瘤組織中JAK－STAT 通路激活密切相關(guān)［17］盧凌鵬等［18］也證實(shí)血清GP73、DCP和VEGF檢測(cè)可協(xié)助AFP診斷原發(fā)性肝癌，聯(lián)合4種標(biāo)志物檢測(cè)可顯著提高原發(fā)性肝癌檢出率。本研究中，通過(guò)對(duì)AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達(dá)與患者預(yù)后之間關(guān)系分析顯示，隨著AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達(dá)升高，患者預(yù)后逐漸變差。本研究聯(lián)合檢測(cè)AFP、AFP－L3、GP73 及DCP4 種腫瘤標(biāo)記物在老年肝癌患者中表達(dá)，每一種血清腫瘤標(biāo)記物都有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合多種血清標(biāo)記物可以通過(guò)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有效且準(zhǔn)確診斷早期肝癌發(fā)展方向。

綜上所述，PHC 發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多步驟復(fù)雜過(guò)程，AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達(dá)可以作為鑒別良惡性腫瘤參考標(biāo)準(zhǔn)，4種腫瘤標(biāo)記物高表達(dá)患者發(fā)生肝癌可能性較大，而高表達(dá)患者預(yù)后較差。對(duì)聯(lián)合檢測(cè)上述指標(biāo)，可以提高肝癌患者早期檢出率，從而對(duì)肝癌早期診斷和早期治療具有重要臨床和實(shí)踐價(jià)值。