王洪曼，黃錚錚，李天牧綜述，高偉，李倩審校

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，山東 濰坊 261053；2.山東省高密市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濰坊 261500；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053)

銅綠假單胞菌在自然界中呈廣泛分布狀態(tài)，除了水、空氣、土壤中，還常分布于人體的皮膚、腸道和呼吸道等與外界相通的部位[1]。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性桿菌，具有條件致病性，可導(dǎo)致多種感染，占非發(fā)酵菌臨床分離率首位，常見(jiàn)于醫(yī)院感染[2]。由于抗生素的濫用等一系列原因，銅綠假單胞菌的耐藥性目前與日俱增，使其成為臨床治療和預(yù)防工作中的一個(gè)難點(diǎn)。銅綠假單胞菌產(chǎn)生藥物耐受性的途徑包括產(chǎn)生藥物滅活酶或藥物修飾酶，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變，通過(guò)改變外排泵的機(jī)制，生物膜的產(chǎn)生等[3,4]。其中，生物膜的產(chǎn)生可使銅綠假單胞菌更加適應(yīng)不良的生活環(huán)境，對(duì)抗生素具備更強(qiáng)的耐藥性，導(dǎo)致感染銅綠假單胞菌后進(jìn)行臨床治療變得更加困難[5]。由于近年來(lái)在臨床治療中許多生物醫(yī)學(xué)材料的出現(xiàn)，為該菌形成生物膜提供了良好的寄生環(huán)境[6]，導(dǎo)致感染和耐藥的發(fā)生率進(jìn)一步增高?，F(xiàn)在，針對(duì)抗生物膜相關(guān)藥物的研究日益增多，如何圍繞生物膜進(jìn)行抗銅綠假單胞菌感染的治療是目前臨床研究的熱點(diǎn)之一，抑制生物膜的合成或加速其分解可有效解決銅綠假單胞菌感染的治療難題[7]。本文將對(duì)抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關(guān)因素及干預(yù)藥物的研究進(jìn)展進(jìn)行分析和綜述。

1 銅綠假單胞菌生物膜及其結(jié)構(gòu)

Costerton于1978年首次提出了生物膜(Biofilm)這一名詞，并提出了細(xì)菌生物膜的相關(guān)理論。細(xì)菌分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等胞外多糖，使其相互黏連，并與細(xì)胞表面受體結(jié)合，吸附細(xì)胞，形成膜樣的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為生物膜[8]。銅綠假單胞菌成熟生物膜的主要組成結(jié)構(gòu)為蘑菇樣或柱樣的亞單位，亞單位包括頭部、莖部和根部三部分，莖部-莖部、頭部-頭部、莖部-頭部之間可形成水通路，類(lèi)似原始的循環(huán)系統(tǒng)，可用于細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的攝取和分泌[9]。

2 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關(guān)環(huán)境因素

2.1 氧濃度對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響 各研究結(jié)論表明，銅綠假單胞菌生物膜的形成離不開(kāi)氧濃度的作用，兩者呈正比關(guān)系[10]。在一定范圍內(nèi)，氧濃度的增加促進(jìn)了藻酸鹽的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致銅綠假單胞菌產(chǎn)生的生物膜數(shù)量逐漸增加，當(dāng)氧濃度為50%時(shí)，生物膜的產(chǎn)生量達(dá)到最高值。因此提供低氧環(huán)境可抑制銅綠假單胞菌生物膜的生成，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 鐵離子對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響 鐵離子可對(duì)生物膜的穩(wěn)定性進(jìn)一步加以鞏固，影響生物膜形成中的靜電作用，對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成發(fā)揮了重要作用，并且可導(dǎo)致生物膜的聚集效應(yīng)[11]。Ehud等[12]的研究表明，銅綠假單胞菌在低鐵條件下，可分解部分生物膜，可以看出鐵離子在穩(wěn)定生物膜方面的作用；Singh等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，銅綠假單胞菌生物膜中如存在乳鐵蛋白，可將其中的鐵離子進(jìn)行螯合，使生物膜在形成過(guò)程中保持移動(dòng)狀態(tài)，同時(shí)不易定植、黏附，降低細(xì)菌聚集的機(jī)會(huì)，有效降低生物膜的形成。

2.3 鎂離子對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響 鎂對(duì)于細(xì)菌的早期黏附起促進(jìn)作用，還可使生物膜的結(jié)構(gòu)在初期和成熟期時(shí)更加復(fù)雜，因此導(dǎo)致生物膜越發(fā)難以消除[14]。再者，鎂離子可以穩(wěn)定細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖，從而在某些抗生素的使用過(guò)程中阻止其進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，無(wú)法發(fā)揮殺菌的作用[15]。因此，降低鎂離子濃度可以協(xié)同清除銅綠假單胞菌的生物膜，并降低細(xì)菌抵抗抗生素的能力。

3 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關(guān)化學(xué)藥物

3.1 抗生素 不同的抗生素對(duì)生物膜的影響不同，從清除生物膜的角度來(lái)說(shuō)，氟喹諾酮類(lèi)的作用最強(qiáng)；而從生物被膜的穿透性角度來(lái)說(shuō)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物在亞抑菌濃度時(shí)具有抑制生物膜的生成和破壞生物膜結(jié)構(gòu)的作用[16]。低濃度紅霉素和阿奇霉素能抑制群體密度感應(yīng)(Quorum-sensing，QS)系統(tǒng)，降低藻酸鹽的產(chǎn)生，廣泛應(yīng)用于臨床的抗生物膜治療[17]。臨床上現(xiàn)在多用藥物聯(lián)合治療銅綠假單胞菌生物膜感染，如阿米卡星與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成具有顯著的抑制作用[18]。

3.2 環(huán)二鳥(niǎo)氨酸 環(huán)二鳥(niǎo)苷酸 (cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一種細(xì)菌中存在的信使分子，它參與調(diào)節(jié)多種生理功能，并在一定程度上影響生物膜的形成[19]。王嵐等[20]通過(guò)基因同源重組，構(gòu)建出銅綠假單胞菌環(huán)二鳥(niǎo)苷酸降解酶磷脂酶D的基因突變株。與野生型相比，基因突變菌株形成生物膜的能力明顯強(qiáng)于野生型，生物膜內(nèi)細(xì)菌聚集能力強(qiáng)于野生型，且有纖維素樣物質(zhì)存在和積累。原因可能是由于基因突變，使合成c-di-GMP的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶被特異性磷酸二酯酶降解減少，導(dǎo)致c-di-GMP增加，使細(xì)菌聚集形成微克隆，有利于在導(dǎo)管材料表面形成生物膜。因此，c-di-GMP增加可能導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐藥性增強(qiáng)。

3.3 殼聚糖及其衍生物 殼聚糖 (chitosan，CHI)是甲殼素經(jīng)過(guò)脫乙酰化后形成，來(lái)源天然，具有抑菌，生物可降解及良好的生物相容性等特點(diǎn)。有研究表明，CHI衍生物殼聚糖季銨鹽(quaternized chitosan，QCHI)可以有效抑制病原微生物的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)[21]，CHI和QCHI均能有效抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，減少其生物膜的形成。與生物膜形成相關(guān)的多種基因的表達(dá)也可受到QCHI的干預(yù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑菌的效果。

4 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關(guān)傳統(tǒng)藥物

4.1 黃芪苷 黃芪苷可以清熱解毒、抗菌消炎，在臨床上可用于消炎治療 黃芪苷的毒副作用較小，抗菌譜廣，可以對(duì)多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生良好的療效。該藥物主要通過(guò)提高生物膜對(duì)其的滲透作用，進(jìn)而提高細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使藥物發(fā)揮更好的抗菌性能，提高臨床治療效果[22]。

4.2 魚(yú)腥草素鈉 魚(yú)腥草素鈉是中藥魚(yú)腥草的活性成分，其衍生物可以有效抑制病原菌感染[23]。研究表明[24]，魚(yú)腥草素鈉可清除銅綠假單胞菌的黏附作用，阻礙其生物膜的形成。魚(yú)腥草素鈉可以通過(guò)對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的清除作用，影響其生物膜的形成，同時(shí)可能引起銅綠假單胞菌形態(tài)變異，從而達(dá)到抑菌的作用。且和抗生素協(xié)同治療，會(huì)有更好的效果[25]。

4.3 金銀花 金銀花是一種清熱解毒的良藥，其有效成分綠原酸和異綠原酸具有抑菌效果。袁秀麗等[26]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花水煎液在體外可影響銅綠假單胞菌生物膜的形成，從而抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)。因此，傳統(tǒng)藥物也可影響銅綠假單胞菌生物膜的形成，要合理運(yùn)用其良好效果?

4.4 大蒜素 大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有抗菌消炎、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多項(xiàng)功能。Lihua等[27]觀察了銅綠假單胞菌在大蒜素的影響下，黏附情況及胞外多糖的合成情況。結(jié)果顯示，在高濃度大蒜素影響下，細(xì)菌的黏附率能力明顯降低，粘附狀態(tài)相對(duì)稀疏，且胞外多糖生成量降低。大蒜素可顯著減少銅綠假單胞菌黏附及產(chǎn)胞外多糖的能力，進(jìn)而有效抑制生物膜的形成。

4.5 云南白藥 云南白藥為具有抗菌消炎、活血化瘀功能的中成藥，其成分中有多種中草藥活性成分[28]。趙祖國(guó)等[29]前期研究結(jié)果表明，云南白藥可影響銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，其提取物通過(guò)干擾銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)、抑制銅綠假單胞菌分泌多種毒素達(dá)到治療目的。

4.6 五倍子醇提液 陳雨等[30]觀察到五倍子醇提液對(duì)銅綠假單胞菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)的降低有一定的促進(jìn)作用，可清除生物膜內(nèi)的細(xì)菌，且在一定條件下五倍子對(duì)銅綠假單胞菌生物膜有一定的清除作用，甚至是完全清除作用。張慧艷等[31]研制的一種抗皮膚感染的中草藥復(fù)方制劑的組方含黃芪和五倍子，體外抑菌試驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明該中草藥復(fù)方制劑在抑菌方面有良好的功效，是一種合理運(yùn)用中草藥且效果優(yōu)良的抗菌產(chǎn)品。

4.7 落葉松皮素 落葉松皮素是天然的鐵螯合劑，來(lái)源廣泛，存在于蕨類(lèi)植物的葉子、落葉松樹(shù)皮及大麥芽中，常用作防腐劑[32]，具有抗菌活性，對(duì)鐵有很強(qiáng)的螯合能力，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。在細(xì)菌生物膜形成初期，鐵螯合劑落葉松皮素可抑制銅綠假單胞菌附著于塑料上；在生物膜由單層細(xì)胞發(fā)育為微菌落這一重要環(huán)節(jié)，落葉松皮素可增強(qiáng)銅綠假單胞菌IV型菌毛介導(dǎo)的顫搐運(yùn)動(dòng)，阻滯微菌落形成過(guò)程，阻止細(xì)菌生物膜成熟，阻礙其立體三維結(jié)構(gòu)的發(fā)育，最終導(dǎo)致銅綠假單胞菌生物膜發(fā)育的減緩[33]。

4.8 白藜蘆醇 QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌生物膜的形成和感染過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。研究[34]顯示，在來(lái)源于買(mǎi)麻滕科植物的QS抑制劑——白藜蘆醇存在的條件下，銅綠假單胞菌的生物膜對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素更敏感；白藜蘆醇和氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)造成了破壞；白藜蘆醇能夠抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中兩種重要信號(hào)分子的表達(dá)。表明白藜蘆醇能顯著增強(qiáng)氨基糖苷類(lèi)抗生素(如妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星和奈替米星)對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的作用，是治療銅綠假單胞菌生物膜感染的潛在促進(jìn)劑，可以恢復(fù)或增強(qiáng)氨基糖苷類(lèi)抗生素的療效。

4.9 蝶呤 蝶呤是蝶啶類(lèi)化合物的一員。研究[35]證實(shí)，蝶呤可以引起細(xì)胞壁的裂解，對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有拮抗作用和抗菌活性。此外，還證明了蝶呤對(duì)生物膜的形成具有抑制作用，能夠明顯降低生物膜的形成量。因此，蝶呤作為一種良好的抗菌藥物，可用于治療各種致病性疾病，并具有被開(kāi)發(fā)成未來(lái)抗耐藥性細(xì)菌抗生素組成部分的潛力。

5 展望

通過(guò)抑制細(xì)菌的致病因子以達(dá)到治療感染的目的，已經(jīng)受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。開(kāi)發(fā)針對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的抗菌藥物或治療方法，成為目前抗銅綠假單胞菌感染的研究重點(diǎn)之一。在銅綠假單胞菌生物膜形成的影響因素中，高氧濃度與高鎂離子都有利于銅綠假單胞菌的生物膜的生成，并且，鐵離子的存在能進(jìn)一步鞏固生物膜的穩(wěn)定性，因此，減少氧濃度，去除鎂離子、鐵離子對(duì)于銅綠假單胞菌生物膜的形成有一定阻止作用。很多化學(xué)藥物與傳統(tǒng)藥物都對(duì)抗銅綠假單胞菌生物膜形成有一定作用，其中傳統(tǒng)藥物在抗銅綠假單胞菌生物膜形成方面有良好的效果，為合理運(yùn)用傳統(tǒng)藥物以及化學(xué)藥物與傳統(tǒng)藥物相結(jié)合治療提供了依據(jù)。隨著治療藥物的進(jìn)一步深入研究，其治病機(jī)制和耐藥機(jī)制也會(huì)更加明確，在清除銅綠假單胞菌生物膜造成的感染方面也將會(huì)有新的進(jìn)展。