楊 穎,胡 家,李 蕾,殷愛紅,李慎濤

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái),北京 100069;*通訊作者,E-mail:lishentao@sina.com)

組蛋白的賴氨酸殘基存在多種翻譯后修飾類型,如乙?；?acetylation)、巴豆?；?crotonylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)和泛素化(ubiquitination)等。這些翻譯后修飾是細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控的方式之一,通常在包括轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)以及染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)等DNA-模板進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1,2]。這些修飾可以被一些效應(yīng)蛋白選擇性地識(shí)別以維持正常的細(xì)胞生長和發(fā)育,識(shí)別過程的失調(diào)控通常與發(fā)育異常和腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[3,4]。識(shí)別過程的調(diào)控機(jī)制已成為目前表觀遺傳調(diào)控相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。YEATS結(jié)構(gòu)域是一類識(shí)別組蛋白?；揎椀拈喿x器。包含YEATS結(jié)構(gòu)域的蛋白與不同修飾組蛋白的親和力存在明顯差異,從而導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮不同的功能[5,6]。近年有關(guān)YEATS蛋白功能的研究多由其與不同修飾組蛋白多肽的相互作用為切入點(diǎn),進(jìn)而深入探究其作用機(jī)制[7]。在這些研究中,等溫滴定微量熱(ITC)技術(shù)是鑒定YEATS蛋白與不同修飾組蛋白多肽相互作用的主要手段[6]。

表面等離子共振(SPR)和ITC技術(shù)是近年來檢測生物分子間相互作用的主要分析技術(shù)。但是,由于組蛋白多肽易與芯片基質(zhì)發(fā)生非特異性的吸附,從而限制了SPR技術(shù)在此領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。本次實(shí)驗(yàn)旨在采用Biacore T200分析系統(tǒng)建立高通量篩選和鑒定與特定蛋白相互作用的組蛋白多肽的SPR方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 SA傳感芯片、HBS-EP+和PBS緩沖液、surfactant P20、5 mol/L NaCl以及200 mmol/L NaOH購自美國GE Healthcare公司;生物素標(biāo)記試劑盒EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin reagents和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;組蛋白多肽(分子量約2 kD)由北京中科亞光生物科技有限公司合成;YEATS2蛋白(分子量25 kD)和牛血清白蛋白BSA購自美國Sigma公司。

1.1.2 儀器 Biacore T200分子互作分析儀,美國GE Healthcare公司;EnVision多標(biāo)記讀板儀,美國PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)在SA芯片表面的固定 用生物素標(biāo)記試劑盒將蛋白(BSA和YEATS2)生物素化,并采用BCA比色法檢測蛋白質(zhì)的濃度。以HBS-EP緩沖液作為蛋白質(zhì)固定過程中的運(yùn)行緩沖液。將SA芯片裝入儀器中,芯片表面用1 mol/L NaCl和50 mmol/L NaOH的混合液潤洗3次,每次60 s,將蛋白質(zhì)用PBS緩沖液稀釋至50 ng/μl的濃度,以30 μl/min的流速分別注入芯片表面Fc1或Fc2通道,最終達(dá)到800 RU左右的固定量。HBS-EP沖洗芯片直至基線穩(wěn)定。

1.2.2 多肽與芯片表面相互作用的測試 用含0.05% P20的PBS緩沖液(PBS-P)作為運(yùn)行緩沖液,檢測前,用PBS-P高流速?zèng)_洗芯片,直至基線穩(wěn)定。將多肽用PBS-P稀釋至250 μmol/L,以30 μl/min的流速分別注入芯片F(xiàn)c1和Fc2通道60 s,先后分別檢測多肽與芯片表面的非特異性結(jié)合以及與BSA和YEATS的結(jié)合水平。

1.2.3 多肽與蛋白質(zhì)作用的親和力分析 將不同多肽用PBS-P分別稀釋至3.9,7.8,15.6,31.2,62.4,125,250 μmol/L,采用動(dòng)力學(xué)分析Wizard模板中的動(dòng)力學(xué)和親和力法進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),以30 μl/min的流速進(jìn)樣,結(jié)合時(shí)間和解離時(shí)間均設(shè)為60 s,以Fc1作為參比通道,用Biacore T200分析軟件擬合所得數(shù)據(jù),計(jì)算不同多肽與蛋白質(zhì)的解離平衡常數(shù)KD。

2 結(jié)果

2.1 BSA對(duì)H3K27cr多肽與芯片基質(zhì)非特異性結(jié)合的影響

將250 μmol/L的H3K27cr多肽注入?yún)⒈韧ǖ繤c1和YEATS2反應(yīng)通道Fc2中,如圖1A所示,當(dāng)Fc1未固定BSA時(shí),Fc1傳感曲線迅速上升到200 RU左右,之后緩慢上升,呈時(shí)間依賴性,解離過程一開始便迅速下降至基線水平,提示多肽與芯片基質(zhì)存在非特異性結(jié)合;而當(dāng)Fc1固定等量BSA時(shí),進(jìn)樣后曲線迅速上升至200 RU,之后維持平臺(tái)期直至進(jìn)樣結(jié)束,無上升趨勢。圖1B顯示Fc2響應(yīng)值扣減Fc1響應(yīng)值得到的傳感圖,排除了多肽與運(yùn)行緩沖液折光率差異的影響,反映多肽與YEATS2蛋白實(shí)際結(jié)合水平。如圖1所示,Fc1未固定BSA時(shí),進(jìn)樣后曲線呈現(xiàn)下降的趨勢,Fc1固定BSA后,多肽與YEATS2的結(jié)合過程顯示為快結(jié)合快解離。

A. H3K27cr與參比通道Fc1結(jié)合的傳感圖 B. H3K27與YEATS2結(jié)合的傳感圖圖1 BSA阻斷H3K27cr多肽與芯片基質(zhì)的非特異性結(jié)合Figure 1 BSA blocked non-specific interaction between H3K27cr peptide and matrix on the chip

2.2 BSA與H3K27多肽相互作用的檢測

為了研究BSA與H3K27多肽是否存在相互作用,使用Fc1固定BSA的芯片,將H3K27cr多肽倍比稀釋成7個(gè)濃度梯度,依次流過芯片表面。傳感圖和擬合結(jié)果顯示,多肽流過BSA表面產(chǎn)生的響應(yīng)值與其濃度呈線性遞增關(guān)系(見圖2),提示BSA與多肽無特異性結(jié)合。

A. BSA與不同濃度的H3K27cr結(jié)合的傳感圖 B. 結(jié)合的響應(yīng)值與H3K27cr濃度的關(guān)系曲線圖2 BSA與H3K27cr多肽無特異性結(jié)合Figure 2 H3K27cr did not bind to immobilized BSA

2.3 YEATS2與不同修飾的H3K27多肽相互作用親和力的檢測

為了比較YEATS2與帶有不同修飾的H3K27多肽相互作用的親和力,將H3K27cr、H3K27ac和H3K27多肽分別倍比稀釋成不同濃度,依次流過固定了BSA和YEATS2蛋白的芯片,Fc2響應(yīng)值扣減Fc1響應(yīng)值所得結(jié)果顯示,H3K27cr和H3K27ac與YEATS2的結(jié)合過程均為快結(jié)合快解離,而H3K27與YEATS2無明顯結(jié)合。隨著H3K27cr和H3K27ac濃度升高,與YEATS2相互作用的結(jié)合信號(hào)也隨之增強(qiáng),與H3K27cr相比,等濃度H3K27ac與YEATS2的結(jié)合水平較低,125 μmol/L的H3K27ac與YEATS2的反應(yīng)響應(yīng)值比等摩爾濃度的H3K27cr低50%(見圖3A)。將數(shù)據(jù)用分析軟件進(jìn)行擬合處理,計(jì)算出多肽與YEATS2相互作用的親和力常數(shù)KD(見圖3B)。YEATS2與H3K27cr作用的親和力最高[KD=(40.83±5.31)μmol/L],其次是H3K27ac[KD=(97.50±6.29)μmol/L],H3K27最低(無法確定KD值)。

3 討論

采用SPR技術(shù)檢測蛋白質(zhì)與多肽的相互作用,通?？梢赃x擇3種固定配體的方法:①通過氨基偶聯(lián)法將蛋白質(zhì)固定在CM5芯片上;②將生物素標(biāo)記的多肽固定在SA芯片上;③將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)固定在SA芯片上。在本研究中,我們采用了第3種固定方式,同樣是將蛋白固定在芯片上,氨基偶聯(lián)法所形成的酰胺鍵的鍵長約為0.13 nm,可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的特異性作用位點(diǎn)失活,而生物素標(biāo)記后間隔臂的長度為前者的20倍,因此SA捕獲法可以充分保留蛋白質(zhì)的結(jié)合活性;但是,組蛋白多肽中賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸含量高,其等電點(diǎn)通常為10-11,而芯片的基質(zhì)葡聚糖的等電點(diǎn)為3.5,多肽在中性的運(yùn)行緩沖液中,易與芯片的基質(zhì)發(fā)生非特異性吸附。因此,第2種固定方式是目前檢測蛋白質(zhì)與多肽相互作用的常用方法[8],但與固定生物素化蛋白方法相比,檢測通量低,芯片消耗量大,不適用于一個(gè)蛋白與3個(gè)以上多肽相互作用的篩選和鑒定實(shí)驗(yàn)。

在一些研究相互作用的生化實(shí)驗(yàn)中,如Western Blot和ELISA,BSA是封閉液的主要成分,用來封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)[9]。此外,在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,無關(guān)抗體常被用來作為特異性抗體的陰性對(duì)照,以排除非特異性相互作用的可能性[10]。在本研究中,我們將等量的生物素標(biāo)記的BSA固定在參比通道上,一方面,用來封閉芯片基質(zhì)上非特異性結(jié)合位點(diǎn),另一方面,代替芯片上的葡聚糖,作為YEATS2的陰性對(duì)照蛋白。由結(jié)果可見,BSA不僅有效地阻斷了H3K27多肽與芯片的非特異性吸附,而且其自身與多肽無明顯結(jié)合活性。

應(yīng)用此方法我們檢測了3個(gè)不同修飾的H3K27多肽與YEATS2蛋白的結(jié)合特征,發(fā)現(xiàn)YEATS2與H3K27多肽的結(jié)合水平和親和力均為H3K27cr> H3K27ac> H3K27,由此可見,YEATS2蛋白傾向于結(jié)合巴豆?；腍3K27組蛋白,與Zhao等[7]采用ITC技術(shù)檢測所得結(jié)論吻合。就KD數(shù)值而言,SPR技術(shù)檢測的YEATS2與H3K27cr和H3K27ac相互作用的KD分別為40.8 μmol/L和97.5 μmol/L,文獻(xiàn)報(bào)道ITC技術(shù)檢測的KD值分別為31.7 μmol/L和226.2 μmol/L[7]。KD數(shù)值的差異與采用不同的技術(shù)原理和反應(yīng)體系相關(guān)。從時(shí)效的角度上比較,本研究方法優(yōu)于ITC技術(shù),用ITC法檢測一對(duì)蛋白與多肽的相互作用耗時(shí)約1.5 h,切換樣品需人工操作;而SPR法可在無人值守的情況下連續(xù)自動(dòng)進(jìn)行一個(gè)蛋白與多至10個(gè)多肽相互作用的檢測。綜上所述,我們首次采用參比通道固定BSA的方法,解決了多肽與芯片非特異性結(jié)合的問題,適用于高通量篩選和鑒定與蛋白質(zhì)相互作用的多肽,可以與ITC技術(shù)配合使用。