王 曦 李志勇 李婉華

（1.廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心）廣東廣州 510435；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心；3.廣州陸橋檢測技術(shù)有限公司）

1 前言

食品、化妝品細(xì)菌菌落總數(shù)測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法中都采用平板計數(shù)瓊脂傾注培養(yǎng)法進行檢測，此方法雖簡單但細(xì)菌菌落容易與樣品殘渣顆?；煜斐善桨寰溆嫈?shù)不準(zhǔn)確。近年來，有學(xué)者建議在平板計數(shù)瓊脂中加入氯化三苯甲基四氮唑（TTC）顯色劑，使菌落顯色紅色，與樣品殘渣顆粒區(qū)分以提高計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性[1]?！痘瘖y品技術(shù)安全規(guī)范》2015版中建議，在每100 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL 0.5‰的TTC溶液[2]可使細(xì)菌菌落變成紅色，便于區(qū)別化妝品中的顆粒，減少計數(shù)誤差。鑒于檢測人員在進行食品、化妝品菌落總數(shù)檢測過程中往往會在平板計數(shù)瓊脂中添加少量TTC顯色劑，但在GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[3]中的平板計數(shù)瓊脂后沒有規(guī)定TTC的使用量，目前我國培養(yǎng)基主要生產(chǎn)廠家在平板計數(shù)瓊脂添加的TTC量也差別較大[4]，而近年來亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，使用含TTC的平板計數(shù)瓊脂對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用。在食品、化妝品菌落總數(shù)檢測中添加一定量的TTC既能很好區(qū)分細(xì)菌菌落與樣品殘渣顆粒夠，又不會對檢測樣品中細(xì)菌菌落生長造成影響，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

2 材料和方法

2.1 材料

PCA（平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基）（北京陸橋技術(shù)有限公司，批號160620，有效期3年）；1%TTC溶液（氯化三苯甲基四氮唑）（北京陸橋技術(shù)有限公司，批號190111，有效期2年）；試驗菌株大腸埃希菌（ATCC873938）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、蠟樣芽胞桿菌（ATCC6538）等（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心）。

2.2 方法

2.2.1 菌種的復(fù)蘇與純化

將上述標(biāo)準(zhǔn)菌種在無菌條件下取出接種腦心浸液（BHI）肉湯中，經(jīng)（36±1）℃、24 h 進行復(fù)蘇培養(yǎng)，然后分別取上述菌株對應(yīng)的選擇性平板（大腸埃希菌-伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板、創(chuàng)傷弧菌-硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）平板、銅綠假單胞菌-十六烷基三甲基溴化銨平板、金黃色葡萄球-Baird-Parker瓊脂平板、蠟樣芽胞桿菌-甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（MYP）平板）經(jīng)（36±）1℃、24 h 培養(yǎng)后從平板上挑取典型菌落接種血平板進行純化培養(yǎng)。

2.2.2 菌液制備

從血平板上挑取菌落用滅菌0.85%生理鹽水充分混勻，制成n×108CFU/mL菌液備用。

2.2.3 培養(yǎng)基制備

PCA培養(yǎng)基配制按產(chǎn)品使用說明制備；不同TTC含量PCA瓊脂的配制：在PCA瓊脂46℃時加入TTC溶液，配制成濃度為 0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰的PCA瓊脂，搖勻放置45℃保溫備用。

2.2.4 測試方法

在無菌條件下用1 mL滅菌吸管分別取上述測試菌液稀釋液1 mL置2個無菌平皿內(nèi)，將加入不同濃度TTC的PCA瓊脂傾注入平皿內(nèi)轉(zhuǎn)動平板使混合均勻，同時將吸取1 mL滅菌生理鹽水于平皿內(nèi)注入無添加TTC的PCA瓊脂作空白對照，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置（36±1）℃溫箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h，觀察結(jié)果。具體操作步驟參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016進行。

2.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將測試數(shù)據(jù)用spss11.0軟件包進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 5個不同TTC濃度試驗組中平板計數(shù)瓊脂上細(xì)菌形態(tài)觀察結(jié)果

含0.1‰～0.5‰的TTC時菌落呈紅色，但顏色深淺不同，TTC濃度在0.1‰的菌落呈現(xiàn)淡紅色，隨TTC濃度越高菌落顏色越來越深，TTC在0.4‰～0.5‰時菌落呈現(xiàn)深紅色，菌落計數(shù)較多時整個平板呈現(xiàn)紅色；大腸埃希菌、創(chuàng)傷弧菌、銅綠假單胞菌等3種革蘭氏陰性菌在0.1‰～0.5‰的TTC平板計數(shù)瓊平板上時其菌落大小與對照組平板計數(shù)瓊脂結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌2種革蘭氏陽性菌在含0.1‰～0.2‰TTC平板計數(shù)瓊平板上菌落大小與對照組平板計數(shù)瓊脂結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在含0.3‰TTC平板計數(shù)瓊平板上菌落明顯變小，含0.4‰～0.5‰TTC平板計數(shù)瓊平板上沒有肉眼可見菌落出現(xiàn)，結(jié)果詳見表1。

3.2 不同濃度TTC菌落計數(shù)瓊脂細(xì)菌計數(shù)檢測結(jié)果

大腸埃希菌組實驗組，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理，其x2=0.229，P=0.994＞0.05，0.1‰～0.5‰ TTC 濃度計數(shù)瓊脂細(xì)菌菌落總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；創(chuàng)傷弧菌組，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理，其 x2=0.153，P=0.997＞0.05，0.1‰～0.5‰TTC濃度計數(shù)瓊脂細(xì)菌菌落總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；銅綠假單胞組，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理，其 x2=0.915，P=0.922＞0.05，0.1‰～0.5‰TTC 計數(shù)瓊脂細(xì)菌菌落總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；金黃色葡萄球菌，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理，TTC濃度為0.2‰時，x2=0.024，P=0.877＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，TTC 濃度為0.3‰時，x2=7.854，P=0.020＜0.05，TTC濃度為 0.4‰、0.5‰時，其P＜0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；蠟樣芽胞桿菌，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理，TTC濃度為0.2‰時，x2=0.036，P=0.850＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，TTC濃度為0.3‰時，x2=9.420，P=0.009＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TTC濃度為 0.4‰、0.5‰時，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見表2。

表1 不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂上細(xì)菌形態(tài)結(jié)果

表2 不同濃度TTC菌落計數(shù)瓊脂細(xì)菌計數(shù)檢測結(jié)果

4 討論

本文選用革蘭陰性腸桿菌科的大腸埃希菌、弧菌科的創(chuàng)傷弧菌、非發(fā)酵菌科的銅綠假單胞、革蘭陽性的金黃色葡萄球及蠟樣芽胞桿菌作為試驗菌，實驗室結(jié)果顯示，使用0.1‰～0.5‰的TCC對革蘭陰性菌的生長無明顯抑制作用；使用0.3‰的TCC對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌革蘭陽性菌有明顯的抑制作用。隨著TTC濃度的增加，其抑制作用越來越明顯，當(dāng)TTC的濃度達(dá)0.4‰時，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌完全抑制，平板計數(shù)瓊脂上沒有肉眼可見菌落生長，這與張軍成等[5]2，3，5-三苯基氯化四氮唑濃度對細(xì)菌菌落總數(shù)測定的影響的結(jié)果相符。

筆者在長期的實驗室工作中對TCC濃度及使用方法進行了研究，為減少配制及添加TTC的麻煩及減少試驗過程的污染，可直接購買商品化含0.4‰TTC和無添加TCC的平板計數(shù)瓊脂，按3∶7的比例稱量混合溶解滅菌后使用（2種瓊脂混合后含TCC為0.12‰），這樣更加方便快捷。

食品污染的細(xì)菌種類很多，主要以腸桿菌科、弧桿菌科、非發(fā)酵菌科、革蘭陽性菌及芽胞桿菌為主。本文選取腸桿菌科的大腸埃希菌、弧桿菌科的創(chuàng)傷弧菌、非發(fā)酵菌科的銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌作為試驗菌種，具有一定的代表性。本研究成果為食品化妝品菌落總數(shù)檢測過程中TTC使用量提供了指導(dǎo)，同時可為日后對修訂《化妝品技術(shù)安全規(guī)范》2015版5.2菌落總數(shù)檢驗方法、減少TTC的添加量提供參考。