張照茹 魏松紅 楊曉賀 王海寧 許月

摘要 ：為明確中國東北地區(qū)水稻紋枯病病原菌種類及融合群的歸屬情況，2015-2017年從黑龍江省、吉林省和遼寧省的17個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)采集水稻紋枯病標(biāo)樣，分離獲得水稻紋枯病菌214株，運(yùn)用水稻紋枯病菌的不同病原菌及融合群的特異性引物對(duì)214株水稻紋枯病菌進(jìn)行病原菌種類和融合群鑒定，并利用rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，對(duì)供試水稻絲核菌的融合群歸屬進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：供試214株水稻紋枯病菌分屬于茄絲核菌Rhizoctonia solani和水稻絲核菌Rhizoctonia oryzae?sativae，菌株數(shù)分別為198株和16株，占比分別為92.52%和7.48%。茄絲核菌菌株分屬于2個(gè)融合群，分別為AG1?IA和AG4，菌株數(shù)分別為191株和7株，占比分別為96.46%和3.54%。水稻絲核菌菌株均屬于AG?Bb融合群，菌株數(shù)為16株。不同年份水稻紋枯病的病原菌種類及融合群出現(xiàn)的頻率和地域分布無明顯變化，而不同地域間水稻紋枯病病原菌的種類及融合群具有明顯的分化特征，AG1?IA融合群在中國東北三省各個(gè)水稻產(chǎn)區(qū)均有分布且均為優(yōu)勢(shì)融合群，AG4融合群在遼寧省盤錦市出現(xiàn)頻率最高，水稻絲核菌AG?Bb融合群在吉林省吉林市、通化市和梅河口市出現(xiàn)頻率最高。

關(guān)鍵詞 ：水稻紋枯病;?茄絲核菌;?水稻絲核菌;?融合群

中圖分類號(hào)：

S 435.111.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018435

Molecular identification of pathogens and anastomosis groups of

rice sheath blight in Northeast China

ZHANG Zhaoru1，?WEI Songhong1，?YANG Xiaohe1，2，?WANG Haining1，?XU Yue1

（1. College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang?110161， China;

2. Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Jiamusi?154007， China）

Abstract

In order to elucidate the pathogens and anastomosis group of rice sheath blight in Northeast China from 2015 to 2017， 214 strains of rice sheath blight were isolated from 17 main rice producing areas in Heilongjiang， Jilin and Liaoning provinces. The specific primers of different pathogens and anastomosis groups of rice sheath blight pathogen were used to identify the pathogens and anastomosis group of 214 isolates， and sequence of the internal transcription spacer of rDNA （ITS） was used to analyze the belonging of the anastomosis group of Rhizoctonia oryzae?sativae. The results showed that 214 isolates belonged to two pathogens. For Rhizoctonia solani and R.oryzae?sativae， the number of strains was 198 and 16， accounting for 92.52% and 7.48%， respectively. R.solani strains belong to two anastomosis groups， the number of AG1?IA and AG4 strains was 191 and 7 accounting for 96.46% and 3.54%， respectively. Phylogenetic analysis of ITS sequence showed that R.oryzae?sativae belonged to AG?Bb. In different years， the occurrence frequency and regional distribution of different populations and anastomosis groups of rice sheath blight pathogen had no significant change， but different populations and anastomosis groups of rice sheath blight pathogen in different regions had obvious differentiation characteristics. AG1?IA anastomosis group distributed in all rice producing areas， and it was the major anastomosis group with the highest frequency in Panjin， Liaoning province. The AG?Bb anastomosis group of R.oryzae?sativae appeared most frequently in Jilin city， Tonghua city and Meihekou city， Jilin province.

Key words

rice sheath blight;?Rhizoctonia solani;?Rhizoctonia oryzae?sativae;?anastomosis group

水稻紋枯病是水稻種植過程中一種常見和多發(fā)的真菌性病害，近年來，隨著施肥水平的提高和多蘗矮稈品種的種植，水稻紋枯病呈逐年加重的趨勢(shì)，成為穩(wěn)態(tài)流行病害[1]。水稻紋枯病主要由茄絲核菌Rhizoctonia solani引起，后又發(fā)現(xiàn)水稻枯斑絲核菌Rhizoctonia oryzae與水稻絲核菌Rhizoctonia oryzae?sativae也可引起紋枯病，但致病力較弱[2]。絲核菌種內(nèi)具有明顯的分化現(xiàn)象，存在著不同的菌絲融合群，到目前為止茄絲核菌的融合群包括AG1～AG13和AG?BI，每個(gè)融合群下又分為多個(gè)亞群。雙核絲核菌融合群命名以1984年Ogoshi等[3]命名的英文字母編號(hào)為準(zhǔn)。

將待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙生長，觀察兩者之間的菌絲是否融合是目前鑒定水稻紋枯病菌融合群歸屬的常用方法，但該方法也有諸多缺點(diǎn)，例如該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、觀測時(shí)容易出現(xiàn)人為錯(cuò)誤，且菌株長期培養(yǎng)后失去融合能力以及標(biāo)準(zhǔn)菌株較難獲得等。近年來，用于水稻紋枯病菌融合群分類的分子生物學(xué)技術(shù)日益增多，包括DNA指紋技術(shù)、特異性PCR鑒定技術(shù)和rDNA測序技術(shù)等。

由于rDNA的ITS區(qū)在不同物種間具有明顯的特異性，目前應(yīng)用 rDNA?ITS 序列進(jìn)行特定融合群鑒定的研究越來越多。Matsumoto[4]設(shè)計(jì)出了鑒定茄絲核菌AG1融合群和AG2融合群下不同融合亞群rDNA的特異性引物，可以快速準(zhǔn)確地鑒定AG1?IA、AG1?IB、AG1?IC、AG2?1和AG2?2融合亞群。伍恩宇[5]設(shè)計(jì)出了鑒定茄絲核菌AG4融合群的特異性引物。Lees等[6]設(shè)計(jì)出了鑒定茄絲核菌AG3融合群的特異性引物。Okubara等[7]根據(jù)rDNA的ITS序列，設(shè)計(jì)出可以快速鑒定茄絲核菌AG2?1融合亞群、AG8融合群、AG10融合群的特異性引物。

本研究利用水稻紋枯病菌不同病原菌和融合群的特異性引物以及ITS序列分析對(duì)分離自黑龍江省、吉林省和遼寧省的17個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)的214株水稻紋枯病菌病原菌和融合群進(jìn)行分子鑒定，旨在為水稻抗病育種、水稻紋枯病預(yù)測預(yù)報(bào)以及水稻紋枯病的綜合防治提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試水稻紋枯病菌采集和分離

2015-2017年從黑龍江省、吉林省和遼寧省17個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)采集水稻紋枯病標(biāo)樣310份。參考周而勛等[8]的水稻紋枯病菌分離方法進(jìn)行病原菌的分離、純化，共獲得水稻紋枯病菌214株，純化菌株轉(zhuǎn)入裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中-4℃保存，供試菌株信息見表1。

1.2?供試水稻紋枯病菌DNA提取

1.2.1?菌絲培養(yǎng)

將供試菌株于PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm打孔器打取3個(gè)菌餅，接種到PD培養(yǎng)液中，恒溫?fù)u床（28℃、120 r/min）培養(yǎng)5 d。

1.2.2?菌絲體制備及DNA提取

恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d后過濾收集菌絲體，在40℃的烘箱中恒溫放置12 h，將烘干后的菌絲體在液氮中充分研磨，使用OMEGA真菌DNA提取試劑盒（D3390?01 OMEGA）提取供試菌株DNA。

1.3?不同水稻紋枯病病原物及融合群特異性引物檢測

各融合群特異性引物（表2）均由上海生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer PCR反應(yīng)緩沖液、200 μmol/L dNTPs、1.25 mmol/L MgCl2、1U Taq DNA聚合酶、10 μmol/L上、下游引物、50 ng模板DNA，由ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸1 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳檢測，電壓120 V，電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照后保存并記錄。

1.4?水稻絲核菌菌株ITS序列分析

利用ITS序列通用引物ITS1和ITS4（表2）對(duì)上述篩選出的水稻絲核菌菌株DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，測得的序列經(jīng)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)后，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其融合群歸屬[12]。

2?結(jié)果與分析

2.1?東北地區(qū)水稻紋枯病病原物種類鑒定

對(duì)214株供試水稻紋枯病病原物種類歸屬情況進(jìn)行特異性分子鑒定，結(jié)果表明（圖1～圖2）：2015年-2017年東北三省供試水稻紋枯病菌中茄絲核菌198株，水稻枯斑絲核菌0株，水稻絲核菌16株，占比分別為92.52%、0%和7.48%。2015年分離獲得茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為56株和6株、占比分別為90.32%和9.68%;2016年分離獲得茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為65株和5株、占比分別為92.86%和7.14%;2017年分離獲得茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為77株和5株、占比分別為93.90%和6.10%。不同年份間水稻紋枯病病原菌種類的出現(xiàn)頻率無明顯變化。源于黑龍江省的茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為60株和4株、占比分別為93.75%和6.25%;源于吉林省的茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為45株和10株、占比分別為81.82%和18.18%;源于遼寧省的茄絲核菌和水稻絲核菌的菌株數(shù)分別為93株和2株、占比分別為97.89%和2.11%。茄絲核菌在我國東北三省稻區(qū)均有分布，而水稻絲核菌在地域間存在較明顯差異，水稻絲核菌出現(xiàn)頻率較高的水稻產(chǎn)區(qū)主要集中在吉林省的吉林市、通化市和梅河口市。

2.2?茄絲核菌融合群分子鑒定

對(duì)上述篩選出的198株茄絲核菌進(jìn)行不同融合群特異性分子鑒定，結(jié)果（圖3～圖4）表明：供試菌株分屬于2個(gè)融合群，分別為AG1?IA融合群和AG4融合群，菌株數(shù)分別為191株和7株，占比分別為96.46%和3.54%。茄絲核菌AG1?IA融合群屬于優(yōu)勢(shì)融合群，且在各水稻產(chǎn)區(qū)均有分布，AG4融合群出現(xiàn)頻率及占比在不同年份間無明顯差異，而在不同地域間存在較明顯差異，遼寧省、吉林省和黑龍江省出現(xiàn)菌株數(shù)分別為5株、1株和1株，占比分別為71.42%、14.29%和14.29%。

2.3?水稻絲核菌融合群分子鑒定結(jié)果

對(duì)篩選出的16株水稻絲核菌進(jìn)行ITS基因序列PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序獲得的目的片段大小均為748 bp。與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比較，BLAST 結(jié)果表明，供試16株菌株與AG?Bb融合群的相似度最高，達(dá)到99%，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），供試16株菌株均與水稻絲核菌AG?Bb融合群位于同一分支上。綜上所述，將16株水稻絲核菌歸屬于AG?Bb融合群。

3?結(jié)論與討論

本研究利用水稻紋枯病不同病原物種類和融合群的特異性引物以及ITS序列分析對(duì)2015-2017年分離自黑龍江、吉林省和遼寧省17個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)的214株水稻紋枯病菌進(jìn)行病原物種類和融合群的分子鑒定，發(fā)現(xiàn)我國東北地區(qū)水稻紋枯病的主要致病菌為茄絲核菌，占總菌株數(shù)的92.52%;其次為水稻絲核菌，占總菌株數(shù)的7.48%;未發(fā)現(xiàn)水稻枯斑絲核菌。茄絲核菌的優(yōu)勢(shì)融合群為AG1融合群下的AG1?IA亞群，占總菌株數(shù)96.46%;其次為AG4融合群，占總菌株數(shù)的3.54%。水稻絲核菌的融合群均為AG?Bb。

據(jù)報(bào)道，水稻紋枯病致病菌有茄絲核菌、水稻枯斑絲核菌和水稻絲核菌[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，我國東北三省稻區(qū)水稻紋枯病致病菌只有茄絲核菌和水稻絲核菌。茄絲核菌在我國東北三省稻區(qū)各地區(qū)均有分布，而水稻絲核菌主要集中在吉林省的吉林市、通化市和梅河口市。導(dǎo)致水稻絲核菌地理分布差異的原因還有待進(jìn)一步研究。

茄絲核菌、水稻枯斑絲核菌和水稻絲核菌在致病性、生物學(xué)特性、遺傳多樣性以及對(duì)殺菌劑的敏感性等方面均存在較大差異[1416]，本研究僅明確了我國東北地區(qū)水稻紋枯病的病原有茄絲核菌和水稻絲核菌，還需進(jìn)行不同水稻紋枯病病原菌分布頻率和地理分布差異的研究，為制定我國東北地區(qū)水稻紋枯病的綜合防控策略奠定病原學(xué)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，AG1?IA融合亞群是東北地區(qū)水稻紋枯病菌的優(yōu)勢(shì)融合群，這一結(jié)果與中國其他地區(qū)的水稻紋枯病菌融合群鑒定結(jié)果一致[1718]。劉志恒等[19]和桑海旭等[20]分別對(duì)遼寧以及遼河三角洲地區(qū)的水稻紋枯病菌進(jìn)行融合群鑒定，其結(jié)果中AG4融合群主要分布在遼寧省盤錦市和丹東市，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。但本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)楊根華等[21]報(bào)道的分離自云南水稻紋枯病的AG1?IC融合亞群和AG?6GW融合亞群，也未發(fā)現(xiàn)張俊華等[22] 報(bào)道的分離自黑龍江水稻紋枯病的AG5融合群，說明水稻紋枯病菌不同融合群的分布與地理區(qū)域具有一定相關(guān)性。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）