張玉霞 袁小遠(yuǎn) 楊金興 孟凱

摘要：為研究雞體內(nèi)miRNA-2127對(duì)低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H9N2復(fù)制的影響，本研究將化學(xué)合成的gga-miR-2127模擬物和抑制劑分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，接種H9N2亞型病毒，檢測(cè)細(xì)胞中病毒含量變化，發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127能夠顯著促進(jìn)病毒的復(fù)制。為探索其中的分子機(jī)制，用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)gga-miR-2127的調(diào)控位點(diǎn)位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，并用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)其靶向關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。熒光定量RT-PCR法和Western blot試驗(yàn)表明，gga-miR-2127過(guò)表達(dá)時(shí)p53的mRNA水平不變而p53蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞天然免疫機(jī)能下降。據(jù)此推測(cè)gga-miR-2127促進(jìn)H9N2復(fù)制的分子作用機(jī)理是在p53基因的mRNA轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)gga-miR-2127與其mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，抑制p53蛋白的翻譯從而抑制抗病毒作用和細(xì)胞的天然免疫機(jī)能。

關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒;gga-miR-2127;分子機(jī)制

中圖分類號(hào)：S852.65+7?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0091-05

Abstract?To study the effect of miRNA-2127 on the replication of low pathogenic AIV?（avian influenza virus） subtype H9N2 in vitro， chemically synthesized gga-miR-2127 mimic and inhibitor were transfected into DF-1 cells inoculated with H9N2 subtype， and the changes of virus content in cells were detected. It was found that gga-miR-2127 could significantly promote the replication of AIV virus. In order to explore the molecular mechanism， the regulatory site of gga-miR-2127 was predicted as 3′UTR region of mRNA of p53 gene by bioinformatics software， and the targeting relationship was validated by double luciferase reporting system. Fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot assay showed that the mRNA of p53 gene remained unchanged while the expression of p53 protein decreased under the condition of?overexpressing gga-miR-2127， and the innate immune function of cells decreased. It was speculated that the molecular mechanism of gga-miR-2127 promoting H9N2 replication was through inhibiting the translation of p53 protein by binding with the 3′UTR region of p53 gene after transcription， so the antiviral effect and the realization of cell innate immune function were inhibited.

Keywords?H9N2 subtype avian influenza virus; gga-miR-2127; Molecular mechanism

H9N2型低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）自1994年在廣東省首次分離到以來(lái)，一直是危害我國(guó)雞群的主要低致病性AIV亞型。該病毒不僅能引起禽呼吸道系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病，造成蛋禽產(chǎn)蛋率下降，肉禽生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)引起患病機(jī)體免疫抑制并激發(fā)其他病原微生物混合感染，造成家禽死亡[1]。

AIV感染家禽后，病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)的互相作用直接關(guān)系到家禽的預(yù)后，研究探索如何提高機(jī)體抗病毒的免疫機(jī)能，調(diào)控感染家禽向健康方向發(fā)展非常必要。p53蛋白是一種分子量為53 kD的磷酸化蛋白，在機(jī)體上皮和造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)，除了作為熱門(mén)的腫瘤抑制蛋白被大量研究之外，p53蛋白在抗病毒[2]及增強(qiáng)宿主的先天及獲得性免疫力[3]方面也有重要作用。因此，如何激活p53蛋白表達(dá)，使其發(fā)揮抗病毒作用，是一項(xiàng)值得深入研究的課題。2006年，Voorhoeve等[4]首次發(fā)現(xiàn)miRNA參與p53信號(hào)通路，是p53信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的分子。近幾年，miRNA在人類抗病毒治療中已開(kāi)展了廣泛的研究。目前雞體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)miRNA幾千種之多，但是對(duì)其功能卻知之甚少。本研究根據(jù)前期研究中H9N2感染DF-1細(xì)胞后miRNA的差異表達(dá)，篩選了顯著升高的miRNA-2127，觀察其對(duì)p53蛋白的影響以及與H9N2病毒復(fù)制的關(guān)系，并試圖闡明背后的分子調(diào)控機(jī)制，以期為抗擊禽流感病毒提供更深層次的解讀，為開(kāi)發(fā)更廣譜的抗病毒基因藥物及尋找新抗病毒靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?毒株和試劑

病毒RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒，購(gòu)自大連TaKaRa公司;轉(zhuǎn)染試劑Iipofectamine 3000，購(gòu)自Invitrogen 公司;pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報(bào)告載體及檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Promega公司;兔抗p53蛋白抗體，購(gòu)自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基，opti-DMEM培養(yǎng)基，犢牛血清，均為Gibico產(chǎn)品。

H9N2亞型1402毒株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng);DF-1細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

gga-miR-2127分子的模擬物與抑制物，購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。模擬物能模擬細(xì)胞內(nèi)成熟miRNA的高水平表達(dá)，以增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA的調(diào)控作用;抑制物可以特異地與成熟miRNA結(jié)合而抑制其作用，削弱細(xì)胞中miRNA導(dǎo)致的基因沉默效應(yīng)，從而進(jìn)行miRNA功能缺失性研究。

1.2?gga-miR-2127對(duì)H9N2病毒復(fù)制的影響試驗(yàn)

預(yù)鋪DF-1細(xì)胞于24孔板，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到50%以上。按Iipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)用opti-DMEM培養(yǎng)液分別稀釋gga-miR-2127模擬物與抑制物和轉(zhuǎn)染試劑，二者混合置室溫孵育20 min，分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，24 h后接種H9N2禽流感病毒，1 h后棄去病毒液，加含2%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液37℃繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒感染24、36、48 h后分別收集細(xì)胞各3孔。按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。參考GenBank發(fā)布的多株H9N2禽流感病毒M基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物（H9N2-M-F/H9N2-M-R）（表1），由北京六合華大基因科技有限公司合成，熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H9N2病毒含量，并同步設(shè)立gga-miR-2127抑制物轉(zhuǎn)染組、NC對(duì)照組（轉(zhuǎn)染時(shí)只加等量opti-DMEM培養(yǎng)液）。

1.3?gga-miR-2127調(diào)控H9N2病毒復(fù)制的分子機(jī)制分析

1.3.1?gga-miR-2127靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證?利用生物信息學(xué)方法（TargetScan、PicTar、miRanda），并參考miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.mirbase.org）分析預(yù)測(cè)gga-miR-2127的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)。

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，gga-miR-2127的靶基因結(jié)合位點(diǎn)位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，為對(duì)此靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)全基因合成方法合成了該結(jié)合位點(diǎn)的野生型與突變型模板，并分別將其克隆到pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報(bào)告載體中，構(gòu)建該結(jié)合位點(diǎn)的野生型與突變型重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將野生型報(bào)告質(zhì)粒、突變型報(bào)告質(zhì)粒分別與gga-miR-2127共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，同步設(shè)立陰性質(zhì)粒與gga-miR-2127共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞對(duì)照組，利用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒分析各組中熒光素酶活性的變化。

1.3.2?gga-miR-2127分別對(duì)p53在基因水平和蛋白水平上表達(dá)的影響檢測(cè)?將gga-miR-2127轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，接種H9N2亞型病毒1402毒株，在接種24、36、48 h后用TRIZOL收集細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆谩⒖糋enBank發(fā)布的p53基因序列，設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物（p53-F/p53-R）（表1）。TRIZOL法提取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的RNA，熒光定量分析不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)p53基因mRNA的表達(dá)水平。

收集轉(zhuǎn)染過(guò)gga-miR-2127并接種H9N2 亞型病毒的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物，采用Western blot方法[5]檢測(cè)p53蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平，同步設(shè)立未轉(zhuǎn)染gga-miR-2127的DF-1感染H9N2 亞型病毒的對(duì)照組。

1.3.3?gga-miR-2127對(duì)多種細(xì)胞因子、炎性因子及抗病毒天然免疫基因表達(dá)的影響檢測(cè)?通過(guò)NCBI中Primer-BLAST工具對(duì)干擾素（IFN-α）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素（IL-1β）、抗病毒因子OAS（2′， 5′-oligoadenylate synthetase）基因及內(nèi)參基因（β-actin）設(shè)計(jì)引物（表1），檢測(cè)不同時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)染gga-miR-2127模擬物和抑制物對(duì)上述抗病毒天然免疫基因及細(xì)胞因子的影響。

2?結(jié)果與分析

2.1?gga-miR-2127對(duì)H9N2病毒復(fù)制的影響

對(duì)DF-1細(xì)胞內(nèi)的H9N2 亞型病毒RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，gga-miR-2127模擬物能夠促進(jìn)病毒的復(fù)制，與抑制物相比有顯著差異，36 h時(shí)差異最顯著（圖1）。

2.2?gga-miR-2127靶基因的生物信息預(yù)測(cè)及靶向功能驗(yàn)證

生物信息法預(yù)測(cè)gga-miR-2127與p53 基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)位于3′UTR區(qū)369 ～ 375 bp之間。根據(jù)該結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建了野生型與突變型重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并將它們分別與gga-miR-2127共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后監(jiān)測(cè)熒光素酶活性變化。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告質(zhì)粒與gga-miR-2127的DF-1細(xì)胞組（gga-miR-2127+野生型）與只轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告質(zhì)粒組（NC+野生型）相比熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而突變型報(bào)告質(zhì)粒與gga-miR-2127共轉(zhuǎn)染組（gga-miR-2127+突變型）較gga-miR-2127+野生型組顯著提高（P<0.05），gga-miR-2127+突變型組、NC+突變型組和NC+野生型組之間差異不顯著（P>0.05）（圖2），說(shuō)明gga-miR-2127能夠靶向調(diào)控p53基因。

2.3?H9N2感染對(duì)p53活性的影響

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染gga-miR-2127模擬物并接種H9N2病毒的DF-1細(xì)胞中p53的mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染gga-miR-2127抑制物組及空白對(duì)照組之間差異不大，說(shuō)明gga-miR-2127未對(duì)p53基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。

采用Western blot法分析兩組細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染gga-miR-2127模擬物組較空白對(duì)照組DF-1細(xì)胞中的p53蛋白表達(dá)量降低（圖3）。

2.4?gga-miR-2127對(duì)多種細(xì)胞因子的影響

通過(guò)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中TNF-α、IL-1β及OAS、IFN-α中的mRNA水平進(jìn)行免疫熒光PCR定量分析，結(jié)果顯示，gga-miR-2127模擬物轉(zhuǎn)染組中TNF-α、IL-1β 含量高于gga-miR-2127抑制組，而OAS、IFN-α則明顯低于gga-miR-2127抑制物轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組（圖4）。

3?討論與結(jié)論

miRNA是一類長(zhǎng)度在21 ～ 25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，廣泛存在于人與各種動(dòng)植物體內(nèi)。人體內(nèi)的miRNA在抗擊口蹄疫病毒、H1N1流感病毒等多種病毒的過(guò)程中起到干擾病毒復(fù)制和調(diào)控病毒基因表達(dá)、激活干擾素等抗病毒基因的作用[6，7]。本研究結(jié)果顯示，gga-miR-2127的模擬物顯著增強(qiáng)了體外H9N2病毒的復(fù)制，且具有時(shí)間依賴性，在病毒接種后36 h差異最顯著。因此，gga-miR-2127可促進(jìn)H9N2禽流感病毒的體外復(fù)制。

miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有重要地位，據(jù)預(yù)測(cè)生物體內(nèi)1/3的mRNA受miRNA調(diào)控。其調(diào)控方式主要有兩種：一是與mRNA直接完全互補(bǔ)，引起靶基因mRNA的降解[8];二是通過(guò)與靶基因的3′UTR之間形成不完全堿基互補(bǔ)，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或阻遏其翻譯[9]。基于miRNA靶基因的預(yù)測(cè)規(guī)則，人們開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的在線軟件，也建立了完善的試驗(yàn)方法驗(yàn)證miRNA靶基因。本研究預(yù)測(cè)gga-miR-2127的靶基因位點(diǎn)位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)。一般條件下，miRNA跟NC對(duì)照相比，野生型載體報(bào)告熒光有所下調(diào)，則認(rèn)為miRNA對(duì)報(bào)告基因有調(diào)節(jié)作用[10]。本研究共轉(zhuǎn)染結(jié)合位點(diǎn)的野生型+gga-miR-2127組較共轉(zhuǎn)染結(jié)合位點(diǎn)的野生型+NC對(duì)照組和突變型+gga-miR-2127組熒光素酶活性均明顯降低，說(shuō)明gga-miR-2127確實(shí)與p53基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，可靶向調(diào)控p53基因。

對(duì)gga-miR-2127轉(zhuǎn)染后DF-1細(xì)胞中的p53基因的mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，gga-miR-2127含量對(duì)其無(wú)顯著影響，而p53蛋白表達(dá)與gga-miR-2127呈負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)染gga-miR-2127模擬物組p53蛋白的表達(dá)含量較未轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯降低，表明gga-miR-2127負(fù)調(diào)控p53蛋白的表達(dá)。據(jù)此推測(cè)，gga-miR-2127是在p53基因轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控蛋白表達(dá)。因此，gga-miR-2127與miR-1285[11]、miR-125a[12]、miR-33[13]和miR-504[14]等相同，均可直接作用于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控p53蛋白的表達(dá)。

病原微生物感染宿主后，激活宿主的天然免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性因子和抗病毒基因抵抗微生物損傷。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，IL-1β是體內(nèi)常見(jiàn)的炎性細(xì)胞因子，本研究表明隨著細(xì)胞內(nèi)H9N2病毒含量的增加，gga-miR-2127模擬物轉(zhuǎn)染組中二者相對(duì)于gga-miR-2127抑制組和NC對(duì)照組顯著增加。OAS為抗病毒天然免疫基因，IFN-α是具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能活性的蛋白質(zhì)，因此本試驗(yàn)選取在機(jī)體抗病毒天然免疫中占重要地位的二者為代表研究gga-miR-2127轉(zhuǎn)染后細(xì)胞免疫機(jī)能的變化。本研究中，二者模擬物轉(zhuǎn)染組隨p53蛋白下降呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，表明二者均受p53蛋白轉(zhuǎn)錄激活參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這與Ouyang[15]、Zuniga[16]等研究基本一致。

由于宿主體內(nèi)miRNA數(shù)目繁多，一個(gè)miRNA可調(diào)控多條mRNA，病毒利用這些宿主細(xì)胞的miRNA通路可促進(jìn)病毒在體內(nèi)的復(fù)制，同時(shí)病毒本身也可編碼miRNA，并利用這些miRNA靶向結(jié)合宿主或病毒基因以逃避抗病毒反應(yīng)。因此，病毒與miRNA的調(diào)控關(guān)系是復(fù)雜的。

綜上，gga-miR-2127體外過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)H9N2亞型病毒體外復(fù)制，其可能的分子機(jī)制是在p53基因的mRNA轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)與其mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，抑制p53蛋白的翻譯從而抑制其抗病毒作用。因此家禽H9N2疫情感染時(shí)，通過(guò)對(duì)gga-miR-2127進(jìn)行調(diào)控，以此發(fā)揮p53蛋白的抗病毒能力及提高機(jī)體先天免疫力或許是治療H9N2疫病的新途徑。

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