亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基于GC/TOF-MS代謝組學方法的人參反藜蘆研究

        2019-02-10 11:38:54郭麗娜
        山西醫(yī)科大學學報 2019年12期
        關(guān)鍵詞:藜蘆藥組代謝物

        郭麗娜,鄭 茜

        (山西醫(yī)科大學藥學院中藥教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:guolinaaa@126.com)

        十八反是中藥的配伍禁忌,沿用千年,最早記錄十八反的是陶弘景《本草經(jīng)集注》,書中記載了19種藥物:甘草反甘遂大戟芫花海藻,藜蘆反細辛芍藥人參丹參沙參玄參苦參,烏頭反半夏瓜蔞貝母白蘞白及,目前公認的十八反藥物來源于此。人參與藜蘆的應(yīng)用歷來存在爭議。藜蘆是一種有毒中藥,歷代醫(yī)藥家論述藜蘆時都注意到其辛苦有大毒,金元時期的朱丹溪云:“服參一兩,入藜蘆一錢,其功盡廢”?!渡褶r(nóng)本草經(jīng)集注》中藜蘆項下注有“反細辛,芍藥,五參”?!侗静菥V目》中又注有“弘景曰:沙參與人參、玄參、丹參、苦參是為五參”[1]?!吨袊幍洹分赋錾鲜鲋T參不宜與藜蘆同用[2]。然而,古方中配伍反藥用于治療病癥的記載仍有存在[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計,明清以來大約130位醫(yī)家用相反藥物的情況,其中人參和藜蘆同用者見7例[4]。另外,國外有研究提出,人參與藜蘆配伍可用于治療肥胖病[5]。綜上,中藥十八反在藥理毒理及物質(zhì)基礎(chǔ)研究都取得一些進展。但從總體來看,集中以一些毒效指標為主要的研究策略,缺乏從整體(臨床患者、實驗動物)、細胞水平及分子水平的系統(tǒng)研究,且對藥物作用于機體產(chǎn)生毒性的機制探討較少[6]。

        “代謝組學”(metabolomics)的概念于2000年首次被Fiehn等[7]提出,這項強有力的研究手段和中醫(yī)藥學的結(jié)合,將探索出中醫(yī)藥復雜理論體系研究的新方法與新途徑[8-10]。通過對代謝組學的形成、基本思想、特點優(yōu)勢、分析策略與技術(shù)以及在中醫(yī)藥若干科學問題研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀等進行分析與論述,并對其進一步應(yīng)用于中醫(yī)藥研究及揭示中藥作用機制等方面進行分析與探討,以期為采用代謝組學方法和技術(shù)揭示中醫(yī)藥現(xiàn)代科學內(nèi)涵提供指引和參考[11]?;谝陨嫌懻?本研究利用基于氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC/TOF-MS)的代謝組學方法,研究不同組合給藥對于動物的毒性差異,及整體代謝的影響,從而使在處方應(yīng)用上有一定的參考價值,使藥物配伍在機制上有依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 藥材與試劑

        藜蘆(購自亳州藥材總公司),人參(產(chǎn)地吉林,購自上海康橋中藥飲片有限公司),分別為百合科藜蘆VeratrumnigrumL.的干燥根莖、五加科人參PanaxgingsengC. A.Mey.的干燥根與根莖。

        水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)20 g,加入200 ml純水,混勻至完全溶解,制成10%水合氯醛液用于麻醉,現(xiàn)用現(xiàn)配。Na2HPO4·12H2O(同上)16.4 g、NaH2PO4·2H2O(同上)5.2 g加水溶解后,再定容至950 ml,最后加入50 ml甲醛(同上),制成甲醛固定液。GOP、GTP、BUN、Cr試劑盒(南京建成生物工程研究所),氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/TOF-MS,Agilent6890/5975B,Agilent科技有限公司),氣相毛細管色譜柱(DB-5 MS,Agilent科技有限公司),微型漩渦混合器(Vortex-Genie 2,美國Scientific Industries,Inc),全自動生化分析儀白立7080(上海日和貿(mào)易有限公司),BioTek PowerWave XS酶標儀;N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA,含1%TMCS)、甲氧胺、尿素酶、L-2-氯苯丙氨酸、十七酸(美國Sigma-Aldrich公司),甲醇、氯仿(CHCl3)、吡啶(國藥集團化學試劑有限公司)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 藥物的配制 取2.5 g藜蘆和25 g人參浸泡1 h后微沸提取1 h,紗布濾過后再加入8倍量水微沸提取0.5 h,合并兩次的提取液得到濾液1。另外,分別取7.5 g藜蘆和75 g人參按照上述方法煎煮,分別得到濾液2和濾液3。靜置24 h后,抽濾。濾液1濃縮至20 ml,此為合煎液;濾液2濃縮至60 ml,取出20 ml再濃縮至10 ml,稱為濃縮液1;濾液3濃縮至60 ml,取出20 ml濃縮至10 ml,稱為濃縮液2。合并濃縮液1和濃縮液2得到合并液。剩余濃縮液1和濃縮液2分別為藜蘆、人參單煎液。每組17只,給藥量0.2 ml/10 g,正常組給相同劑量的蒸餾水。

        1.2.2 動物及給藥 昆明種小鼠102只(18-22 g),雄性,由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)于12 h晝夜交替的環(huán)境,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將所有小鼠隨機分為6組:正常對照組、單煎藜蘆組、單煎人參組、人參藜蘆前后給藥組、人參藜蘆合并組、人參藜蘆合煎組,每組17只。根據(jù)預(yù)實驗及相關(guān)文獻[12-18]確定2.5 g/kg作為單煎藜蘆的濃度,人參濃度為25 g/kg。分別按照0.2 ml/10 g灌胃給予藜蘆單煎液、人參單煎液、人參藜蘆合煎液、人參藜蘆合并液,人參藜蘆前后給藥組先給人參單煎液,1 h后給予藜蘆單煎液,正常對照組給予蒸餾水。單次給藥后禁食12 h后處理動物,心臟取血靜置一段時間后,以4 000 r/min離心10 min,分離上層血清置1.5 ml離心管中,-40 ℃儲存?zhèn)溆?將血清衍生化后待GC-MS進樣分析。

        1.2.3 GC/TOF-MS進樣及數(shù)據(jù)處理 氣相色譜和質(zhì)譜條件:進樣口溫度260 ℃,進樣量1.0 μl;不分液進樣,載氣,高純氮(99.999%);流速,1.0 ml/min;接口溫度280 ℃;色譜柱,DB-5MS毛細管柱;色譜柱升溫程序見表1。離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,溶劑延遲,5 min;電子碰撞電離電壓,70 eV,質(zhì)譜全掃描范圍(m/z):30-550,采用全掃描方式。

        血清衍生化及進樣:取出血清樣本,室溫解凍搖勻,吸100 μl血清于1.5 ml的離心管中,加入十七酸作為內(nèi)標,加入300 μl甲醇 ∶氯仿=3 ∶1作為代謝物提取溶劑,漩渦震蕩30 s,將混合液置于-20 ℃冰箱,10 min幫助蛋白沉淀,10 000 r/min離心10 min,吸取上清液300 μl于1.5 ml的高回收進樣瓶中,在室溫下將其真空干燥,氮氣吹干。吹干后加入15

        表1 GC/TOF-MS色譜柱溫箱升溫程序Table 1 GC/TOF-MS temperature programming

        mg/ml甲氧胺80 μl,封蓋器封口,震蕩30 s后,于30 ℃下?lián)u床中反應(yīng)90 min,反應(yīng)結(jié)束后加入80 μl BSFTA(含1%TMCS),振蕩30 s,在70 ℃的烘箱里反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后振蕩10 s,室溫放置1 h后,待GC-MS進樣分析。

        數(shù)據(jù)前處理與模式識別:原始數(shù)據(jù)經(jīng)Agilent MSD工作站NIST軟件轉(zhuǎn)化為NetCDF格式后,導入R軟件中,采用XCMS工具箱處理,該程序?qū)⒆詣訄?zhí)行基線校正、峰辨識、峰對齊等計算過程,最終得到一個由指定的峰指數(shù)、樣品名稱、峰面積組成的三維矩陣表。將得到的三維矩陣導入Simca-P11.5軟件進行多維統(tǒng)計分析,經(jīng)過中心化、標準化后進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析法(partial least square-discriminant analysis,PLS-DA),用來考察樣本總體代謝物譜圖分布狀況,以觀察樣品的聚集、離散及離群點。尋找與疾病最相關(guān)的代謝差異物,權(quán)重系數(shù)變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)越大,表明該變量對模型的貢獻最大,采用VIP>1表示多維統(tǒng)計上有差異的代謝物。

        2 結(jié)果

        2.1 全部實驗組代謝譜比較的PCA得分和PLS-DA得分

        給藥后,每組僅有10只小鼠的數(shù)據(jù)有效。正常對照組、單煎人參組、單煎藜蘆組、前后給藥組、合并組、合煎組的代謝譜在非監(jiān)督的PCA下差異不明顯,在監(jiān)督的PLS-DA下空白組和給藥組有較為明顯的差異,且單煎人參組對生物的代謝影響大于單煎藜蘆組(見圖1,2),分析原因可能是人參濃度過高的,其大補元氣的作用更強。從圖中還可看出兩種藥物的組作用明顯強于單味藥。

        圖1 全部組別代謝譜比較的PCA得分圖Figure 1 PCA score plot of metabolic profiles in all groups

        圖2 全部組別代謝譜比較的PLS-DA得分圖Figure 2 PLS-DA score plot of metabolic profiles in all groups

        2.2 單煎藜蘆組和合煎組代謝譜比較的PCA得分和PLS-DA得分

        合煎組比單煎藜蘆組多人參,十八反仍是研究的重點,觀察藥物合用是否對生物體有影響。從圖可知兩組的代謝譜圖有明顯差異,在PLS-DA模式下差異明顯(見圖3)。這種差異是必然的,因為多一味人參,且其濃度很大。當然不排除人參和藜蘆合用之后對生物體的作用增強。

        進而發(fā)現(xiàn)了9種差異代謝物,合煎組和單煎藜蘆組之間的代謝物有較為明顯的差異,血清代謝差異物結(jié)果見表2。

        圖3 合煎組、單煎藜蘆組代謝譜比較的PLS-DA得分圖Figure 3 PLS-DA score plot of metabolic profiles in mixed-decoction group and veratrum nigium group

        表2 合煎組、單煎藜蘆組代謝差異物Table 2 Differential metabolites in mixed-decoction group and veratrum nigium group

        2.3 前后給藥組和合并組代謝譜比較的PCA得分和PLS-DA得分

        前后給藥組和合并組都屬于人參和藜蘆單煎后再給藥,區(qū)別是合并組比前后給藥組人參和藜蘆先接觸1 h對生物體產(chǎn)生影響。從圖可知兩組的代謝譜圖有明顯差異,在PLS-DA模式下差異明顯(見圖4)。這說明人參和藜蘆合并后藥物成分發(fā)生了變化,或者前后給藥組的人參先接觸機體后發(fā)揮作用1 h,再給藥藜蘆發(fā)揮作用,區(qū)別于合并之后對機體的影響。

        圖4 前后給藥組和合并組代謝譜比較的PLS-DA得分圖Figure 4 PLS-DA score plot of metabolic profiles in combination group and mixture group

        進而發(fā)現(xiàn)了11種差異代謝物,前后給藥組和合并組之間的代謝物有較為明顯的差異,血清代謝差異物結(jié)果見表3。

        表3 前后給藥組、合并組代謝差異物表Table 3 Differential metabolites in mixture group and combination group

        2.4 合并組和合煎組代謝譜比較的PCA得分和PLS-DA得分

        為了觀察合并組、合煎組對生物體的影響,經(jīng)過PCA和PLS-DA考察代謝圖譜分布狀況。從圖5可知兩組的代謝譜圖有明顯差異,在PLS-DA模式下差異明顯。合并和合煎的區(qū)別在于一個是單煎后藥液合并,一個是兩種原藥材一起煎煮。其中人參和藜蘆的濃度是相同的,但可能在煎煮方式的不同,使得藥物成分發(fā)生變化。

        進而發(fā)現(xiàn)了14種差異代謝物,合并組和合煎組之間的代謝物有較為明顯的差異,血清代謝差異物結(jié)果見表4。

        圖5 合并組和合煎組代謝譜比較的PLS-DA得分圖Figure 5 PLS-DA score plot of metabolic profiles in mixture group and mixed-decoction group

        表4 合并組、合煎組代謝差異物表Table 4 Differential metabolites in mixture group and mixed-decoction group

        2.5 前后給藥組、合并組和合煎組

        前后給藥組、合并組、合煎組中人參和藜蘆的濃度都相同,區(qū)別在于單煎后人參先給藥藜蘆后給藥、單煎人參藜蘆合并后給藥、合煎后給藥。在PCA模式下三組的代謝譜差異明顯,而在PLS-DA模式下更明顯。從圖6,7中可以看出前后給藥組和合并組在Comp2上可以區(qū)分,而這兩組與合煎組則在Comp1上可以明顯區(qū)分,且合煎組對生物體的影響明顯大于另外兩組。

        圖6 合并組、前后給藥組、合煎組組別代謝譜比較的PCA得分圖Figure 6 PCA score plot of metabolic profiles in mixture group, combination group and mixed-decoction group

        圖7 合并組、前后給藥組、合煎組組別代謝譜比較的PLS-DA得分圖Figure 7 PLS-DA score plot of metabolic profiles in mixture group, combination group and mixed-decoction group

        3 討論

        給藥前每組有17只小鼠,給藥后由于藥物作用或者灌胃技術(shù)等原因,每組只剩10只小鼠收集到有效血清以供數(shù)據(jù)監(jiān)測,這也說明人參劑量過大、藜蘆中的藜蘆堿等毒性成分或者人參與藜蘆配伍的原因都使小鼠造成一定程度的死亡或者小鼠的血清收集量過少,這也為“人參反藜蘆”理論提供了某些依據(jù)。

        代謝組學的對比主要針對三類比較,即單煎藜蘆組和合煎組、合并組和合煎組、前后給藥組和合并組。合并組和合煎組的區(qū)別在于煎藥方式,一個是單煎藜蘆、人參后合并,一個是人參、藜蘆一起煎煮。兩種藥物在高溫下是否會相互作用,從PLS-DA結(jié)果中可以看出是有差異的,從內(nèi)源性代謝物角度看,異亮氨酸有明顯差異,異亮氨酸是支鏈氨基酸,目前已有相關(guān)研究表明支鏈氨基酸與胰島素抵抗、2型糖尿病、癌癥和心血管等疾病密切相關(guān),說明在生物體內(nèi)當以上多種內(nèi)源性產(chǎn)物代謝發(fā)生紊亂時,都會產(chǎn)生與其相關(guān)的代謝性疾病[19]。差異性內(nèi)源性代謝物肌酐和尿素分別是肌肉代謝和蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物,反映腎臟的功能,對腎臟代謝廢物的能力產(chǎn)生影響。果糖的差異性變化說明不同的煎煮方式導致糖類代謝水平發(fā)生了變化。

        合并組和前后給藥組都是單煎藥物給藥,區(qū)別在于前后給藥組的藜蘆要晚1 h接觸機體,且從兩者的PLS-DA結(jié)果中看出兩者合并之后藥物成分可能發(fā)生了變化。

        合煎組和單煎藜蘆組的對比在于觀察人參和藜蘆配伍是否對生物體有不同的影響。兩組之間的代謝物有較為明顯的差異,內(nèi)源性差異代謝物異亮氨酸、尿素和肌酐說明兩種煎煮方式擾亂了氨基酸代謝和能量代謝以及腎臟功能代謝,表明人參和藜蘆相互作用確實對生物體的代謝情況有一定的影響。

        從各組的PLS-DA模式上可以看出,人參對生物體的影響大于藜蘆組,可能是人參劑量過大造成的,也有可能藜蘆沒有表現(xiàn)出毒性即預(yù)實驗結(jié)果并未重復。楊亮等[16]利用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù),由主成分分析圖OPLS-DA可見,合煎液、合并液及合并液再煎液三組樣品得到明顯的區(qū)分。王宇光等[20]利用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA),得出合并液與合煎液化學指紋圖譜的差異能夠得到明顯的區(qū)分。因此,結(jié)合相關(guān)文獻報道,可以得出結(jié)論,合煎液和合并液在代謝譜上是有差異的。綜上所述,這三組比較均擾亂了氨基酸的生物合成及代謝、機體的能量代謝、肌肉代謝、蛋白質(zhì)代謝及糖代謝,為藜蘆和人參配伍后內(nèi)源性代謝物靶標的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

        人參和藜蘆自《本草經(jīng)集注》中提出之后,歷來存在爭議,對該問題的研究也該逐步深入。古今中外許多醫(yī)家仍舊將其合用來治療相關(guān)疾病,當代研究更是從各種角度尋找其作用機制。另外,體外化學成分研究表明[21],配伍后藜蘆定的含量均升高,分析其原因可能為人參皂苷類成分有助溶作用,增加了藜蘆定的溶解度而使其含量增加,也可能是化學反應(yīng)導致相關(guān)成分溶出速率增加。但是不得不承認,現(xiàn)有結(jié)果仍不能對兩者的應(yīng)用提供任何證明,其撲朔迷離的狀態(tài)仍然無法解決。古訓宜尊古而不可泥古,應(yīng)持科學態(tài)度進行臨床驗證。代謝組學技術(shù)在中藥的研究中已取得了一定的成果,但也應(yīng)看到,當前代謝組學的研究還處于模式識別和生物標記物鑒定層次,應(yīng)該結(jié)合其他學科如蛋白組學、基因組學、轉(zhuǎn)錄組學等進行綜合的認識與制定標準。相信不久將來,人參和藜蘆的應(yīng)用必將得到科學的闡明,中藥十八反作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)的“黑匣子”必將被揭開,從而為中藥臨床合理用藥提供科學的依據(jù)。

        猜你喜歡
        藜蘆藥組代謝物
        藜蘆的本草考證
        阿爾茨海默病血清代謝物的核磁共振氫譜技術(shù)分析
        新疆牧場阿爾泰藜蘆的開發(fā)利用前景
        草食家畜(2021年2期)2021-04-21 15:09:48
        格列美脲聯(lián)合胰島素治療2型糖尿病的臨床效果觀察
        12β-羥基藜蘆酰棋盤花堿在小鼠體內(nèi)的代謝
        中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
        12β-羥基藜蘆酰棋盤花胺對小鼠小腦和大腦皮層組織DNA損傷的影響
        中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:12
        柱前衍生化結(jié)合LC-MSn分析人尿中茶堿及其代謝物
        HPLC-MS/MS法分析乙酰甲喹在海參中的主要代謝物
        試論補陽還五湯中黃芪與活血藥組的配伍意義
        不同時期RNA干擾水通道蛋白4對早期創(chuàng)傷性腦水腫影響的觀察
        午夜视频网址| 日日躁夜夜躁狠狠躁超碰97| 四虎精品免费永久在线| 亚洲精品一区二区视频| 日本免费在线不卡一区二区| 国产精品18久久久| 国产nv精品你懂得| 日本在线中文字幕一区二区| 在线观看日本一区二区三区四区| 精品人妻中文无码av在线| 国产欧美日韩午夜在线观看| 国产啪啪视频在线观看| 尤物在线观看一区蜜桃| 少妇无码av无码专区线| 国产在线视欧美亚综合| 男人的天堂av你懂得| 久久亚洲av成人无码电影a片| 国产亚洲精品久久久久秋霞| 久久久久AV成人无码网站| 亚洲国产精品国自产拍性色 | 国产成人综合亚洲看片| 久久艹影院| 精品人妻久久av中文字幕| 国产一区二区三区毛片| 国产亚洲av综合人人澡精品| 国产精品无码久久久久久久久作品| 日本妇女高清一区二区三区| 又色又爽又黄高潮的免费视频| 精品无码久久久久久久动漫| av网址大全在线播放| 西川结衣中文字幕在线| av无码久久久久不卡网站下载| 人妻少妇精品无码系列| 蜜桃视频一区二区三区四| 果冻传媒2021精品一区| 欧美日韩区1区2区3区| 丝袜美腿一区在线观看| 亚洲av日韩aⅴ无码色老头| 日韩在线不卡免费视频| 国产激情视频在线观看首页| 蜜臀av色欲a片无码精品一区|