黃祥元，唐 偉，龍冰雁

反芻動(dòng)物消化過程產(chǎn)生氫氣、甲烷和二氧化碳，這些氣體是全球變暖的主要因素。甲烷是一種溫室氣體，其導(dǎo)致全球變暖的潛力是二氧化碳的21倍。瘤胃中產(chǎn)生甲烷的能量損失相當(dāng)于動(dòng)物飼料總能量的6%～10%（易禮勝等，2002）。所有人為產(chǎn)生的甲烷中大約30%是由腸道排放的，主要來(lái)自瘤胃中飼料的發(fā)酵。FAO預(yù)計(jì)，到2050年全球肉類和牛奶產(chǎn)量將翻一番，而這些產(chǎn)量的增加也將對(duì)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。許多化學(xué)添加劑具有減少瘤胃甲烷排放的潛力，但這些添加劑要么對(duì)有益的瘤胃微生物產(chǎn)生副作用，要么對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生毒性。因此，急需尋求安全的方法來(lái)改變瘤胃發(fā)酵特性。植物提取物包括次生代謝物，已在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和食品防腐劑中使用了幾個(gè)世紀(jì)，植物提取物可作為瘤胃發(fā)酵的調(diào)控劑來(lái)減少甲烷生成（Kim等，2012）。金銀花是一種傳統(tǒng)的藥用植物，在韓國(guó)、日本和中國(guó)很常見。嚴(yán)雪龍等（2016）報(bào)道，金銀花提取物具有其他生物和藥物特性，包括抗炎、抗菌、抗病毒，同時(shí)也顯示出肝臟保護(hù)功能。Park等（2014）研究表明，金銀花甲醇提取物中黃酮類化合物含量約為71.023 g，主要成分為表沒食子兒茶素。表沒食子兒茶素是一種黃烷3醇化合物，包括兒茶素、天然酚、抗氧化劑和濃縮單寧。濃縮單寧與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，根據(jù)其來(lái)源和使用的濃度顯示出有害和有益的影響，飼用豆科植物的濃縮單寧可通過抑制產(chǎn)甲烷菌來(lái)降低瘤胃甲烷的排放。因此，本研究通過體外試驗(yàn)評(píng)估金銀花提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵、揮發(fā)性脂肪酸組成及氣體產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃接種與體外培養(yǎng) 以體重為450 kg的肉牛作為瘤胃液供體。苜蓿草和濃縮料按照60∶40的比例加工成全混合日糧，每天分別在早上9點(diǎn)和下午5點(diǎn)對(duì)肉牛各飼喂1次，飼喂量為體重的2%。每天早上飼喂前給肉牛提供水、礦物質(zhì)和維生素，并收集其瘤胃液。瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后與緩沖液混合，并在39℃下保存。將15 mL的瘤胃液緩沖混合物（2∶1）分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和金銀花提取物（0%、3%、5%、7%和9%）。將血清瓶灌滿無(wú)氧氮?dú)?，蓋上橡膠塞，置于搖瓶（120r/min）中39℃孵育48 h。體外試驗(yàn)采用45個(gè)血清瓶（5個(gè)處理×3次孵育×3次重復(fù)）。

1.2 瘤胃體外發(fā)酵特性及其他產(chǎn)生 參考Theodorou等（1994）的研究方法測(cè)定氣體產(chǎn)量。采用改進(jìn)的尼龍袋消解法測(cè)定離體干物質(zhì)降解率。在孵育后，一個(gè)帶有基質(zhì)的尼龍袋在水浴中用以100 r/min洗2次，每次30 min。然后將洗過的尼龍袋60℃烘干至恒重。用血清瓶的重量差來(lái)計(jì)算干物質(zhì)降解率。揮發(fā)性脂肪酸含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，使用添加堿-次氯酸鹽混合培養(yǎng)的苯酚顯色劑對(duì)氨氮進(jìn)行分析。

1.3 微生物豐度分析 微生物PCR引物設(shè)計(jì)及定量方法參考Denman等（2007）研究方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用SAS統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)軟件，采用常規(guī)線性模型程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過與對(duì)照對(duì)照比較，確定金銀花添加水平對(duì)培養(yǎng)物pH、干物質(zhì)降解率、氨氮、揮發(fā)性脂肪酸、氣體生成和微生物豐度的影響，并Duncan"s 進(jìn)行多重比較，確定差異顯著性。用正交多項(xiàng)式對(duì)比處理確定線性和二次效應(yīng)，以評(píng)估不同金銀花添加水平的線性和二次曲線效應(yīng)。所有分析均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃發(fā)酵特性 由表1可知，pH值與金銀花添加水平呈正相關(guān)。在12 h時(shí)，金銀花提取物組較對(duì)照組顯著提高了瘤胃氨氮濃度（P＜0.05）。整體來(lái)看，5%金銀花提取物組似乎更有價(jià)值。

2.2 瘤胃揮發(fā)性脂肪酸 由表2可知，在24 h時(shí)，隨著金銀花提取物水平的升高，瘤胃總脂肪酸濃度顯著降低（P＜0.05），但乙酸濃度隨金銀花提取物水平的升高表現(xiàn)為顯著升高（P＜0.05），但丙酸濃度隨著金銀花提取物水平的升高在12 h時(shí)表現(xiàn)為顯著降低（P＜0.05），乙酸與丙酸比例表現(xiàn)為顯著線性升高（P＜0.05）。

2.3 瘤胃發(fā)酵氣體產(chǎn)生 由表3可知，隨著金銀花濃度的升高，氣體總量在瘤胃體外發(fā)酵24 h后有升高趨勢(shì)（P=0.05），同時(shí)，金銀花提取物水平在3%時(shí)也有顯著提高瘤胃體外發(fā)酵24 h后氣體總量的趨勢(shì)（P=0.06）。隨著金銀花提取物水平的升高，甲烷生成量表現(xiàn)為顯著線性降低（P=0.01）。

2.4 瘤胃微生物含量 由圖1可知，對(duì)照組微生物表達(dá)量均高于其他各組，其中金銀花提取物添加水平為3%時(shí)較對(duì)照組顯著降低了白色瘤胃球菌的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），但對(duì)照組與9%金銀花提取物組對(duì)白色瘤胃球菌相對(duì)表達(dá)量的影響差異顯著（P＞0.05）。金銀花提取物組產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低了30%多（P＜0.05），而3%金銀花提取物水平組黃化瘤胃球菌組降低了29%（P＜0.05）。0、3%、5%、7%和9%金銀花提取物組產(chǎn)甲烷菌分別降低45%、26%、44%和29%。

3 討論

瘤胃氨氮濃度是日糧氮向微生物氮轉(zhuǎn)化效率的粗略預(yù)測(cè)因子，微生物氮是瘤胃細(xì)菌合成的主要氮源。單寧可以降低瘤胃中蛋白質(zhì)降解和脫氨的速度，降低瘤胃氨氮濃度。氨氮濃度的降低可能是由于部分氨基酸的脫氨基作用減少，或可用性下降造成的氨基酸蛋白質(zhì)降解，這可能是由于濃縮單寧蛋白復(fù)合物的形成，選擇性抑制微生物或酶參與分解代謝的蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孵育24 h后，干物質(zhì)降解率隨金銀花濃度的增加呈線性下降，這與Tan等（2011）的研究結(jié)果一致。

表1 金銀花提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵特性的影響

表2 金銀花提取物對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

表3 金銀花提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵氣體產(chǎn)生的影響

圖1 金銀花提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵12h后細(xì)菌表達(dá)量的影響

Paengkoum等（2015）發(fā)現(xiàn)，添加來(lái)自山竹果果皮中的濃縮單寧可以降低乙酸和丙酸的濃度，并增加乙酸與丙酸的值，且隨著濃縮單寧濃度的增加，揮發(fā)性脂肪酸總濃度呈線性下降，同時(shí)也降低瘤胃發(fā)酵速率。本研究結(jié)果顯示，添加金銀花提取物在24 h內(nèi)顯著降低干物質(zhì)降解率，這反映了其對(duì)微生物活性的負(fù)面影響。Paengkoum等（2015）研究表明，來(lái)自山竹果皮的濃縮單寧降低了氣體總量的產(chǎn)生，并導(dǎo)致氣體產(chǎn)量隨濃縮單寧濃度的增加線性下降。孵育48 h時(shí)，隨著金銀花濃度的增加，二氧化碳呈線性下降，作者推測(cè)金銀花提取物中的單寧抗產(chǎn)甲烷活性取決于單寧類型和劑量。

濃縮單寧可以抑制瘤胃中主要的纖維分解菌，其抑制程度取決于單寧類型和劑量。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示了不同的結(jié)果，產(chǎn)甲烷古菌在3%、5%、7%和9%的金銀花提取物組分別減少45%、26%、44%和29%。與其他濃度相比，3%金銀花提取物降低了纖毛蟲數(shù)量。金銀花是藥用植物，具有抗菌特性，可能通過消化大量瘤胃細(xì)菌而降低微生物蛋白合成。Kim等（2012）用金銀花提取物與瘤胃液孵育的體外試驗(yàn)和定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)物中纖毛蟲相關(guān)的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量比對(duì)照組顯著降低，而纖維分解菌數(shù)量增加。其認(rèn)金銀花提取物含有皂苷、有毒生物堿和單寧等化合物，對(duì)細(xì)菌有毒害作用。

4 結(jié)論

金銀花提取物可以影響體外瘤胃發(fā)酵，金銀花提取物可作為一種瘤胃發(fā)酵調(diào)節(jié)劑來(lái)抑制甲烷的產(chǎn)生，同時(shí)對(duì)瘤胃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化產(chǎn)生最小的影響。同時(shí)它也可以通過抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和活性，或通過減少與產(chǎn)甲烷菌相關(guān)的原生動(dòng)物的數(shù)量來(lái)降低甲烷產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%金銀花提取物添加水平顯著降低甲烷排放。