1.西南大學(xué)藥學(xué)院/中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400715；2.西南醫(yī)科大學(xué)護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000；3.瀘州欣康科技有限公司，四川 瀘州 646000

香舒丸，由香附、當(dāng)歸、漏蘆、王不留行、夏枯草等中藥組成，具有疏肝解郁、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、理氣鎮(zhèn)痛的功效，主治肝郁氣滯、血瘀痰凝型乳腺增生。該方在臨床上應(yīng)用二十余年，能夠減輕乳房疼痛、減小乳房腫塊及調(diào)節(jié)性激素水平等，但香舒丸的毒理學(xué)研究目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究依據(jù)《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》[1]《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]《藥物重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]等進(jìn)行香舒丸的急性毒性和長期毒性試驗(yàn), 為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 香舒丸，批號K170601，10 g/袋，由四川綠葉制藥股份有限公司提供。臨床人每日推薦劑量為22 g·60 kg-1。用蒸餾水配制香舒丸能通過灌胃針的最大濃度7.26 g·mL-1用于急毒試驗(yàn)中的給藥組；配制濃度為1.1 g·mL-1、2.2 g·mL-1及4.4 g·mL-1分別用于長毒試驗(yàn)中的香舒丸11 g·kg-1、22 g·kg-1、44 g·kg-1組，此三個(gè)劑量分別為臨床推薦劑量的30、60、120倍。

血液生化檢測試劑盒：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號：140217011)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號：140117013)，堿性磷酸酶(ALP，批號：140317009)，尿素(Urea，批號：141317010)，肌酐(Crea，批號：141017010)，總蛋白(TP，批號：140817009)，白蛋白(ALB，批號：140917006)，葡萄糖(Glu，批號：141517008)，總膽固醇(T-CHO，批號：141617010)，三酰甘油(TG，批號：141717012)，肌酸磷酸激酶(CK，批號：142517009)，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；電解質(zhì)分析儀校正液(批號：20190108)，購自上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司；溶血?jiǎng)?批號：20171021)、稀釋液(批號：111102)，購自上海東湖儀器試劑科技有限責(zé)任公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 儀器 5417R型臺(tái)式低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，BS-220型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，XFA6130型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司)，XD-685型電解質(zhì)分析儀(上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司)，ASP300型組織脫水機(jī)、EG1150H型石蠟包埋機(jī)、RM2235型組織切片機(jī)、ST4040型半自動(dòng)染色機(jī)、DM4000型電子顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級KM小鼠20只，雌性，體質(zhì)量(20±2)g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2017-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號No.0005059；SPF級SD大鼠80只，雌性，體質(zhì)量(200±20)g，購于重慶市中藥研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2017-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號No. 0005115。飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK (渝)2014-0002。溫度20～25℃，相對濕度：40%～60%，光照12 h/12 h明暗交替。

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)[2,4-5]預(yù)試驗(yàn)中因受藥物濃度及小鼠最大給藥容積的影響，給藥后小鼠未出現(xiàn)死亡，無法計(jì)算出香舒丸對小鼠的半數(shù)致死量(LD50) 及最大耐受量，故正式試驗(yàn)進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。取雌性小鼠20只，隨機(jī)分為對照組和給藥組，每組10只。以能通過16號灌胃針的最大濃度7.26 g·mL-1、最大灌胃體積0.04 mL·g-1給藥，給藥2次，間隔12 h，對照組給予等體積蒸餾水，給藥后即刻觀察藥物的毒性反應(yīng)及死亡情況。連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的毒性反應(yīng)、死亡情況、體重及攝食量，觀察期結(jié)束后，進(jìn)行血液生化學(xué)檢測，肉眼檢查各主要臟器組織病變情況，計(jì)算臟器系數(shù)[臟器系數(shù)=臟器重(g)/體重(g)×100%]和最大給藥量。若給藥組的臟器組織的大小、顏色、質(zhì)地與正常臟器有所差異，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2.2 長期毒性試驗(yàn)[3-6]取雌性SD大鼠80只，隨機(jī)分為對照組、香舒丸11 g·kg-1組、22 g·kg-1組和44 g·kg-1組(分別相當(dāng)于臨床劑量的30、60、120倍)，每組各20只。連續(xù)灌胃給藥13周，每日1次，給藥容積0.01 mL·g-1。對照組給予等體積蒸餾水。每日觀察大鼠的一般表現(xiàn)，每周測大鼠體重、攝食量。給藥13周后，每組各隨機(jī)取10只大鼠，檢測血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)，觀察臟器大體形態(tài)學(xué)，稱重、計(jì)算臟器系數(shù)，觀察并記錄對照組和香舒丸44 g·kg-1組臟器組織病理學(xué)變化。余下大鼠停藥正常喂養(yǎng)4周，恢復(fù)期結(jié)束后，檢測指標(biāo)與上述指標(biāo)相同。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性試驗(yàn) 連續(xù)觀察14 d，無小鼠死亡，未出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng)，自主活動(dòng)、呼吸、飲食、糞便等均未見異常，無脫毛及皮毛顏色改變，眼、口、鼻未見分泌物。與對照組相比，給藥組小鼠體重(如圖1所示)、攝食量(如圖2所示)、血液生化學(xué)指標(biāo)(ALT、AST、ALP、ALB、TP、Glu、Crea、Urea、TG、T-CHO、CK，見表1)、臟器系數(shù)(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢，見表2)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肉眼觀察主要臟器(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺、胃、小腸、大腸等) 的位置、形狀、大小、色澤、質(zhì)地等均未見明顯異常。由灌胃最大濃度7.26 g·mL-1、最大體積0.04 mL·g-1，給藥2次，得小鼠的最大給藥量為580.8 g·kg-1，該劑量相當(dāng)于人臨床每日推薦用量的1584倍。

表1 香舒丸對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

表2 香舒丸對小鼠臟器系數(shù)的影響

2 長期毒性試驗(yàn)

2.1 香舒丸對大鼠一般表現(xiàn)的影響 連續(xù)給藥13周及恢復(fù)4周，未見大鼠死亡，未出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng)，各組大鼠試驗(yàn)期間自主活動(dòng)、呼吸、飲食、糞便未見明顯異常，無脫毛及皮毛顏色改變，鼻、口腔、眼、生殖器等未見異常分泌物。

2.2 香舒丸對大鼠體重和攝食量的影響 各組大鼠體重逐周增加，攝食量變化趨勢相同。連續(xù)給藥13周及恢復(fù)4周，與對照組相比，各給藥組大鼠體重、攝食量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖3、4所示。

2.3 香舒丸對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 連續(xù)給藥13周及恢復(fù)4周，與對照組相比，各給藥組大鼠血液學(xué)指標(biāo)(RBC、HGB、PLT、HCT、MCH、MCV、MCHC、WBC)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 香舒丸對大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 連續(xù)給藥13周，與對照組相比，各給藥組血液生化學(xué)指標(biāo)(ALT、AST、ALP、ALB、TG、TP、T-CHO、CK、Glu、K+、Na+、Cl-)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中香舒丸44 g·kg-1組Urea顯著升高、Crea顯著降低(P<0.01)，且隨著劑量的增加而分別呈上升、下降趨勢，但都在大鼠的正常生理值范圍內(nèi)[4]；恢復(fù)4周，各給藥組血液生化學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 香舒丸對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

表4 香舒丸對大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

續(xù)表4 表4 香舒丸對大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

注：與對照組相比，aP<0.01。

2.5 香舒丸對大鼠大體形態(tài)學(xué)的影響 給藥13周及恢復(fù)4周，對照組與香舒丸44 g·kg-1組受檢臟器及組織(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺、胃、小腸、大腸)的位置、形狀、大小、色澤、質(zhì)地等均未見明顯異常。

2.6 香舒丸對大鼠臟器系數(shù)的影響 給藥13周及恢復(fù)4周，與對照組相比，各給藥組大鼠的臟器系數(shù)(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢)均無顯著性差異(P>0.05)，見表5。

2.7 香舒丸對大鼠臟器組織的影響 給藥13周，香舒丸44 g·kg-1組僅1例腎臟輕微礦化，見圖5。對照組與香舒丸44 g·kg-1組其他臟器或組織(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、卵巢、乳腺)均未發(fā)生明顯病理改變。恢復(fù)4周，對照組與香舒丸44 g·kg-1組臟器或組織均未發(fā)生明顯病理改變。

表5 香舒丸對大鼠臟器系數(shù)的影響

3 討論

急性毒性試驗(yàn)中，由于預(yù)試驗(yàn)受香舒丸濃度及小鼠灌胃體積的限制，無法測出香舒丸對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)、最大耐受量(MTD)，故采用最大給藥量法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。為了更全面的顯示香舒丸可能存在的急性毒性，除記錄了《中藥、天然藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》所規(guī)定的一般狀況、體重、攝食量、大體解剖等外，又增加了血液生化學(xué)以及臟器系數(shù)的檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，灌胃香舒丸的小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性變化，且最大給藥量為580.8 g·kg-1，相當(dāng)于人臨床每日推薦用量的1584倍，表明香舒丸對小鼠無明顯的急性毒性反應(yīng)，可供臨床使用[7]。

長期毒性試驗(yàn)中，給藥13周后，香舒丸44 g·kg-1組大鼠Urea顯著高于對照組、Crea顯著低于對照組，但其數(shù)值均在實(shí)驗(yàn)室大鼠血生化指標(biāo)正常生理值范圍內(nèi)，且Crea的降低無臨床實(shí)際意義，組織病理學(xué)檢查中僅1例腎臟出現(xiàn)輕微礦化，其他臟器及組織未出現(xiàn)明顯的病理變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)及毒理學(xué)評價(jià)意義，考慮為個(gè)別大鼠自發(fā)性病變；恢復(fù)4周后該組大鼠Urea、Crea水平與對照組無顯著差異，且各臟器及組織未出現(xiàn)明顯的病理變化。從總體來看，香舒丸各劑量未對給藥期及恢復(fù)期大鼠的一般表現(xiàn)、體重、攝食量、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、系統(tǒng)尸檢、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)等指標(biāo)產(chǎn)生與藥物毒性相關(guān)的異常變化。提示在本試驗(yàn)條件下, 香舒丸對大鼠無明顯的蓄積毒性及延遲毒性作用。

香舒丸在臨床上治療肝郁氣滯、血瘀痰凝型乳腺增生具有良好的效果。同期試驗(yàn)也表明，香舒丸能夠減輕乳腺增生模型大鼠的乳房腫脹、調(diào)節(jié)性激素水平及相關(guān)蛋白的表達(dá)、減輕乳腺組織的增生等。本試驗(yàn)中，香舒丸對雌性小鼠、大鼠均未見明顯的急性毒性及長期毒性反應(yīng)，表明香舒丸在臨床推薦劑量下服用是較安全的。因此，該處方在臨床上值得進(jìn)一步臨證推廣應(yīng)用。同時(shí)，將該處方開發(fā)為治療乳腺增生疾病的中成藥制劑也具有極大的必要性。