沈林波，吳楠楠,2，馮小艷，王文治，熊國(guó)如，趙婷婷，張樹珍

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究中心/熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？? 571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京，210095)

甘蔗宿根矮化病(Sugarcane Ratoon Stunting Disease ,RSD)是影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)的一種細(xì)菌性病害，1944年，在澳大利亞蔗區(qū)的甘蔗品種Q28上首次發(fā)現(xiàn)該病害[1]，目前，該病害在全球各個(gè)蔗區(qū)均廣泛分布[2-4]。甘蔗宿根矮化病在發(fā)病初期沒有典型的外部癥狀，在發(fā)病嚴(yán)重時(shí)才表現(xiàn)出明顯癥狀，表現(xiàn)為蔗株矮化、分蘗減少、蔗莖變細(xì)、節(jié)間縮短、生長(zhǎng)不良、田間植株高矮不齊等[5]，這些癥狀與甘蔗在干旱、養(yǎng)分不足時(shí)的表現(xiàn)相似，因此，從外觀上很難判斷蔗株是否發(fā)病。甘蔗宿根矮化病有時(shí)會(huì)表現(xiàn)出內(nèi)部癥狀，感病的幼嫩蔗株的生長(zhǎng)點(diǎn)變成淡粉色，成熟蔗株近基部節(jié)部維管束變色，出現(xiàn)橘紅色或紅褐色的小圓點(diǎn)、逗點(diǎn)、短線狀病變，但是這些癥狀有時(shí)不會(huì)表現(xiàn)出來[6]。甘蔗宿根矮化病的病原菌是木質(zhì)部賴氏菌木質(zhì)部亞種(Leifsoniaxylisubsp.xyli, Lxx)[7]，一種專性寄生于木質(zhì)部維管束中的革蘭氏陽性菌，菌體呈直或微彎的細(xì)長(zhǎng)棒狀，有的中部或一端膨大，內(nèi)有間體，菌體大小為0.25～0.5μm×1.0～4.0μm。Lxx主要通過帶菌蔗種、收獲機(jī)具和砍種刀具等媒介進(jìn)行傳播[8-9]。甘蔗在宿根時(shí)，隨著宿根年數(shù)的增長(zhǎng)，宿根矮化病所造成的病蔗的蔗汁稀釋至10 000 倍仍具有傳染力，傳染性極強(qiáng)[10]。此外，動(dòng)物在咀嚼帶病甘蔗后咬食健康的甘蔗也會(huì)傳播該病菌[11]。甘蔗宿根矮化病會(huì)造成有效莖數(shù)、單莖重、蔗糖分量的減少，從而影響甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)[12-13]，可使甘蔗產(chǎn)量減產(chǎn)10%～30%[13-16]。在干旱缺水的條件下，宿根矮化病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，甘蔗產(chǎn)量減產(chǎn)可高達(dá)60%[7]，蔗糖分降低0.5%，經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前，種植甘蔗脫毒種苗是預(yù)防甘蔗宿根矮化病的最有效措施，巴西、印度、古巴等甘蔗生產(chǎn)大國(guó)均采用種植甘蔗脫毒種苗的途徑來防治甘蔗宿根矮化病[4]。甘蔗宿根矮化病在發(fā)病不嚴(yán)重時(shí)沒有明顯的外部癥狀，難以從外觀上進(jìn)行診斷，同時(shí)病原菌Lxx的分離培養(yǎng)較困難，因此聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)法是目前檢測(cè) RSD使用最廣泛和準(zhǔn)確的方法[17-18]。筆者從我國(guó)甘蔗主產(chǎn)區(qū)的12個(gè)甘蔗產(chǎn)區(qū)(簡(jiǎn)稱蔗區(qū))收集甘蔗樣品598份，利用PCR方法對(duì)RSD的病原菌Lxx進(jìn)行分子檢測(cè)，旨在明確我國(guó)蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)生情況，為甘蔗脫毒健康種苗的推廣應(yīng)用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料2017年從廣西、云南、廣東和海南等省份12個(gè)代表性蔗區(qū)采集顯癥或不顯癥的甘蔗葉片樣品598份。以本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)過鑒定感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗葉片為陽性對(duì)照，滅菌雙蒸水為空白對(duì)照。

1.2 試劑甘蔗DNA提取相關(guān)試劑(Sigma)，PCR相關(guān)試劑(TaKaRa)，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen)，瓊脂糖(Sigma)，引物合成及測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，其他常用的化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 甘蔗葉片總DNA的提取甘蔗葉片總DNA的提取采用CTAB法[19]，取200 mg甘蔗葉片，剪碎后用液氮研磨成粉末，裝入2.0 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液(0.1 mol·L-1Tris-Cl pH8.0, 1.4 mol·L-1NaCl, 0.02 mol·L-1EDTA pH8.0, 2% CTAB, 2%PVP, 3%β-巰基乙醇)，混勻后于65 ℃溫浴1 h。加入1mL的V氯仿∶V異戊醇=24∶1，顛倒混勻，常溫10 000 r·min-1離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，于-20 ℃放置10 min，常溫10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用75%的乙醇洗滌沉淀2次，常溫10 000 r·min-1離心2 min；棄上清，用80 μL ddH2O溶解沉淀,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?μL DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 PCR檢測(cè)引物采用Lxx的16S～23S rDNA基因間隔區(qū)特異引物L(fēng)xx1: 5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′，目的片段大小為438 bp，PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，Lxx1和Lxx2(10 μmol·L-1)各1μL，DNA模板1μL，rTaq酶0.14 μL，加 ddH2O補(bǔ)足 20 μL 。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 10 min[20-21]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 PCR產(chǎn)物序列分析對(duì)部分PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit (Axygen)試劑盒進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物連接19T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，將菌液檢測(cè)結(jié)果呈陽性的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性分析。

1.6 分析12個(gè)蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)分析12個(gè)蔗區(qū)收集的甘蔗樣品中RSD檢測(cè)呈陽性的樣品數(shù)，并計(jì)算12個(gè)蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果用Lxx的特異性引物對(duì)Lxx1和Lxx2進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：陽性對(duì)照及部分樣品(圖1)可以擴(kuò)增得到大小約為438 bp目的條帶，空白對(duì)照無目的條帶。隨機(jī)挑選部分陽性樣品PCR的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast同源性分析顯示，與已報(bào)道的Lxx的16S～23S rDNA核酸序列(EU723209.1，AF034641.1)有高達(dá)99%的同源性，表明它們是Lxx基因組的部分序列，這些樣品中存在Lxx細(xì)菌，說明樣品已感染了宿根矮化病。

圖1 部分樣品RSD的PCR檢測(cè)M：MarkerDL2000；1：陽性對(duì)照， 2：無菌雙蒸水；3～24：甘蔗樣品Fig.1 PCR detection of RSD in partial samples M: MarkerDL2000; 1: Positive control; 2: Sterile double distilled water; 3-24: Sugarcane samples

2.2 我國(guó)12個(gè)蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)病情況對(duì)我國(guó)12個(gè)蔗區(qū)的RSD檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表1)顯示，來源于12個(gè)蔗區(qū)的598個(gè)樣品中有99個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽性，平均檢出率為16.56%。12個(gè)蔗區(qū)的RSD檢出率各不相同，其中RSD在臨滄蔗區(qū)的檢出率最高，為27.78%，其次是德宏蔗區(qū)，檢出率為25.00%，南寧蔗區(qū)的檢出率最低，4.88%，百色、柳城、崇左、保山、湛江和臨高等蔗區(qū)的RSD檢出率均較低，在5.45%～9.76%之間。

表1 我國(guó)12個(gè)蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)生情況

2.3 不同甘蔗栽培品種RSD發(fā)生情況對(duì)15個(gè)甘蔗栽培品種RSD的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表2)，結(jié)果顯示，15個(gè)甘蔗栽培品種均能檢測(cè)到RSD，陽性檢出率為15.38%～44.44%，其中新臺(tái)糖22號(hào)RSD發(fā)病最嚴(yán)重，陽性檢出率為44.44%，新臺(tái)糖16號(hào)和粵糖93-159 RSD發(fā)病較嚴(yán)重，分別為42.86%和40.00%，海蔗22號(hào)RSD發(fā)病最輕，陽性檢出率為15.38%，其余11個(gè)甘蔗品種的RSD陽性檢出率為16.67%～37.75%。

表2 不同甘蔗栽培品種RSD發(fā)生情況

3 討 論

通常PCR檢測(cè)RSD使用的材料多為甘蔗汁，但是由于甘蔗汁取樣過程繁瑣、易污染，且組培苗和處于苗期的甘蔗無法取汁，因此，使用甘蔗汁作為檢測(cè)材料具有局限性，而使用甘蔗葉片作為檢測(cè)材料可避免上述情況[22]。趙婷婷等[20, 23]使用甘蔗植株不同位置的葉片及葉片的不同部位作為材料來檢測(cè)RSD，發(fā)現(xiàn)PCR檢測(cè)效率差異不明顯。因此，本研究采用甘蔗葉片作為材料，通過PCR法進(jìn)行RSD的檢測(cè)。

王曉燕等[13]在2012—2014年，對(duì)云南省18個(gè)蔗區(qū)宿根矮化病的發(fā)生情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18個(gè)蔗區(qū)都檢測(cè)到RSD，檢出率為75.62%，28個(gè)主栽品種均感染RSD，檢出率51.2%～100%，粵糖93-159、粵糖00-236等10個(gè)甘蔗品種感病嚴(yán)重，RSD在云南省各蔗區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。韋金菊等[12]在2013—2014年，對(duì)廣西蔗區(qū)9個(gè)主產(chǎn)區(qū)的宿根矮化病的發(fā)生情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)主產(chǎn)區(qū)均檢測(cè)出RSD，陽性檢出率為71.22%；27個(gè)甘蔗品種均能檢測(cè)到RSD，其中主栽品種新臺(tái)糖22號(hào)發(fā)病嚴(yán)重，檢出率達(dá)80.8%；新植蔗的RSD檢出率為36.0%，宿根蔗的RSD檢出率為75.7%，宿根時(shí)間越長(zhǎng)，RSD檢出率越高，宿根矮化病在廣西蔗區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。本研究共收集了598份甘蔗樣品，其中99份能檢測(cè)到宿根矮化病，全國(guó)蔗區(qū)平均檢出率為16.56%，全國(guó)12個(gè)蔗區(qū)均能檢測(cè)到RSD，云南蔗區(qū)的RSD檢出率為21.28%，廣西蔗區(qū)的RSD檢出率為17.42%。收集到的15個(gè)主要甘蔗栽培品種均能檢測(cè)到RSD，陽性檢出率為15.38%～44.44%，其中新臺(tái)糖22號(hào)RSD發(fā)病最嚴(yán)重，陽性檢出率為44.44%，海蔗22號(hào)RSD發(fā)病最輕，陽性檢出率為15.38%。對(duì)比前人的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)云南蔗區(qū)和廣西蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的檢出率均大幅度下降，云南蔗區(qū)的RSD檢出率降低了54.34%，廣西蔗區(qū)的RSD檢出率降低了53.80%。結(jié)果表明，雖然宿根矮化病在我國(guó)蔗區(qū)仍然普遍存在，但是由于我國(guó)近年采取推廣種植甘蔗脫毒健康種苗等防治措施，宿根矮化病的發(fā)生已得到了很大程度的控制。目前，預(yù)防宿根矮化病發(fā)生的最有效措施就是種植甘蔗脫毒健康種苗。雖然我國(guó)蔗區(qū)現(xiàn)在宿根矮化病的發(fā)生比2012—2014年有所降低，但是其在我國(guó)蔗區(qū)仍然普遍存在，而且在15個(gè)甘蔗主要栽培品種上均有檢測(cè)到了RSD，說明目前對(duì)宿根矮化病的預(yù)防還需重視，在今后的甘蔗生產(chǎn)中應(yīng)加大力度推廣種植甘蔗脫毒健康種苗。