劉威 袁芳艷 周丹娜 劉澤文 楊克禮 段正贏 郭銳 高婷 梁婉 田永祥

摘要：從湖北地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場疑似腹瀉病料中成功檢測并分離獲得了一株豬流行性腹瀉病毒，分離毒株感染Vero細胞可引起明顯的細胞病變，病毒效價達1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。間接免疫熒光結果顯示HB201602感染細胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識別，進一步證實所分離毒株為PEDV病毒?；赟1基因構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，表明2011年后分離的毒株大多以G2型變異毒株為主，HB201602屬于G2-a亞型（變異毒株）簇。S1基因遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)G1-b亞型毒株與其他簇毒株相比存在9個特異的氨基酸突變，G1-a亞型經(jīng)典毒株存在4個特異的氨基酸突變，S1基因的變異分析將有助于了解PEDV的遺傳變異趨勢，為新型疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

關鍵詞：豬流行性腹瀉;分離鑒定;序列分析;系統(tǒng)發(fā)育樹;遺傳變異

中圖分類號：S852.65+1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0227-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.055 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and identification of HB201602 strain of porcine epidemic

diarrhea virus and phylogenetic tree analyses based on S1 gene

LIU Wei，YUAN Fang-yan，ZHOU Dan-na，LIU Ze-wen，YANG Ke-li，DUAN Zheng-ying，

GUO Rui，GAO Ting，LIANG Wan，TIAN Yong-xiang

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Science-observation Experiment Station of Veterinary Medicine and Diagnostic Technology （Ministry of Agriculture and Rural Affairs），Wuhan 430064，China）

Abstract： Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） HB201602 strain was isolated from the piglets suspected to be suffering a severe diarrhea in Hubei Province. The isolated strain can infect Vero cells and cause obvious cell pathological change， with viral titer up to 1.0×105.6 TCID50/0.1ml. Indirect immunofluorescence results indicated that HB201602 infected cells could be recognized by monoclonal antibodies against PEDV S protein， further confirming that the isolated strain was PEDV virus. Phylogenetic trees were constructed based on S1 gene， and the results indicated that most of the strains isolated after 2011 were G2 variant strains， and HB201602 belonged to G2-a subtype （variant strain） cluster. Genetic variation analysis of S1 gene shows that G1-b subtype strain has 9 specific single amino acid mutations compared with other cluster strains， and G1-a subtype classical strain has 4 specific amino acid mutations. Variation analysis of S1 gene will provide a basis for understanding the genetic variation trend of PEDV and the development of new vaccines.

Key words： porcine epidemic diarrhea virus; isolation; sequence analysis; phylogenetic tree; genetic variation

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種高度接觸性腸道傳染病[1]，各年齡和品種的豬均易感，成年豬感染后臨床癥狀表現(xiàn)輕微，但對哺乳仔豬危害最為嚴重，感染仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡，發(fā)病率高達100%，死亡率為30%～80%[2]。

1971年，該病在英國首次報道，隨后在英國、德國、比利時、西班牙等地呈現(xiàn)流行態(tài)勢。近年來，PED在北美洲和亞洲出現(xiàn)暴發(fā)，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2013年，美國暴發(fā)PED疫情，隨后迅速傳播至其他州以及毗鄰的加拿大和墨西哥。1976年，中國首次報道了PED的流行，近年來，流行性腹瀉疫情呈上升趨勢[3-5]。豬流行性腹瀉平均每年造成了美國和中國超過8百萬頭仔豬的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[6-8]。

PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的α冠狀病毒，是一種單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，5端有一個帽子結構（cap），3端有一個poly（A）尾，由7個ORFs組成，主要的結構蛋白為纖突糖蛋白（S）、小囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[9，10]。S蛋白由S1（1-735 aa）和S2（736-1356 aa）兩部分組成，S1主要介導病毒與宿主細胞受體的結合，S2可通過誘導構象改變促使病毒進入宿主細胞[11，12]。研究表明，PEDV S基因突變更能表現(xiàn)PEDV的變異情況，不同地區(qū)不同時間分離毒株的核酸差異主要集中在S基因，因此PEDV S基因常用于研究不同毒株之間的親緣關系、遺傳變異、流行特征以及毒力預測等[13，14]。

本研究從湖北省自發(fā)仔豬腹瀉疫病的豬群中采集糞便樣品，進行了病毒的分離培養(yǎng)、通過RT-PCR核酸片段檢測以及間接免疫熒光（IFA）試驗，證實所分離毒株為PEDV，同時測定了病毒的TCID50，并對其S1基因進行了序列測定以及遺傳進化分析，為下一步生物學特性及疫苗開發(fā)等研究奠定了基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病料來源 ?豬流行性腹瀉典型臨床病例采集自湖北省不同地區(qū)豬場，采樣豬場中出現(xiàn)仔豬嚴重腹瀉、嘔吐、脫水以及死亡等疑似病例，采集樣品為發(fā)病豬的糞便或小腸內(nèi)容物等。

1.1.2 ?工具酶及主要試劑 ?各種限制性內(nèi)切酶（Restriction endonuclease，RE）、高保真酶PrimerSTARTM、dNTPs、逆轉錄試劑盒、DNA Marker等工具酶購自寶生物工程（大連）有限公司;雙抗（青霉素-鏈霉素）溶液、RPMI-1640培養(yǎng)基、Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基購自美國GIBCOTM公司;DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司;膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;Vero傳代細胞系和抗PEDV S蛋白單克隆抗體（MAb）由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病毒的分離與培養(yǎng) ?糞便樣品經(jīng)PBS重懸離心后取上清液，提取上清液中RNA，利用逆轉錄試劑盒制備cDNA，并使用PEDV檢測引物（表1）對獲得的cDNA進行檢測。檢測為陽性的上清液樣品通過0.45 μm濾器除菌后，接種于Vero傳代細胞系，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱（5%）中恒溫恒濕培養(yǎng)，每天觀察細胞病變（CPE）。收獲細胞病變明顯樣品，反復凍融3次后，繼續(xù)接種Vero傳代細胞系，連續(xù)體外傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ?病毒的間接免疫熒光（IFA）鑒定 ?將HB201602

分離病毒株感染Vero單層細胞，感染24 h后棄掉維持液，使用4 ℃預冷的90%乙醇固定20 min（維持4 ℃低溫），棄去固定液，自然干燥，PBS洗滌3次，每次5 min，自然干燥。以抗PEDV S蛋白MAb（1∶1 000）作為1抗，以抗鼠IgG-FITC（1∶2 000）作為二抗，在熒光倒置顯微鏡下觀察檢測結果，對分離毒株進行IFA鑒定。

1.2.3 ?S1基因測序及進化分析 ?以HB201602分離毒株RNA為模板，逆轉錄試劑盒制備cDNA，設計引物擴增PEDV S1基因（表1）。將RT-PCR擴增得到的DNA產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進行純化，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列的測定。在NCBI GenBank中下載國內(nèi)外PEDV代表性毒株的S1基因序列，采用MEGA軟件對包括HB201602分離毒株在內(nèi)的23株PEDV S1基因進行進化分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?臨床樣品RT-PCR檢測

將采集的8份臨床疑似樣品經(jīng)處理后通過RT-PCR方法對其進行檢測。結果表明，8份臨床樣品均擴增出大小約為660 bp的目的片段，與預期目的條帶大小一致（圖1）。

2.2 ?病毒的分離與效價測定

RT-PCR檢測確定的陽性臨床樣品經(jīng)過處理后，在Vero細胞中連續(xù)體外培養(yǎng)傳代，進行病毒分離。其中編號為201602的樣品在連續(xù)傳代后仍然可以感染Vero細胞引起明顯的細胞病變（CPE），將該分離的毒株命名為HB201602，并測定了病毒效價，其效價為1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。

2.3 ?間接免疫熒光（IFA）鑒定

利用抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體MAb（4C7株），對PEDV分離株HB201602感染細胞進行間接免疫熒光檢測。結果表明，分離毒株HB201602感染Vero細胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識別，在熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光，證實所分離毒株為PEDV病毒，且能在Vero細胞中復制增殖（圖2）。

2.4 ?HB201602分離株S1基因序列測定及其進化分析

以PEDV臨床分離毒株HB201602提取的RNA為模板，RT-PCR擴增S基因部分片段，PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并將位于850 bp處的DNA產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化，克隆至T載體上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。并與NCBI GenBank中下載的國內(nèi)外PEDV參考毒株S1基因進行序列比較分析，利用MEGA軟件對包括HB201602分離毒株在內(nèi)的33株PEDV S1基因進行進化分析（圖3）。

2.5 ?S1蛋白表面抗原突變分析

以PEDV臨床分離毒株HB201602提取的RNA為模板，RT-PCR擴增S1基因部分片段，并對其基因序列進行測定。以NCBI中32株PEDV毒株S1基因為研究對象，進一步分析了S1基因的遺傳變異規(guī)律（圖4）。

3 ?討論

自2010年中國暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情以來，PEDV已迅速席卷了中國各地，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[15]。本研究從湖北省規(guī)?；B(yǎng)殖場臨床腹瀉病料中成功檢測并分離獲得了一株豬流行性腹瀉病毒，分離毒株感染Vero細胞可引起明顯的細胞病變，病毒效價經(jīng)測定達1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。間接免疫熒光檢測結果顯示，分離毒株HB201602感染Vero細胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識別，在熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光，進一步證實所分離毒株為PEDV病毒。

冠狀病毒的S蛋白主要識別宿主細胞受體，與之結合并誘導產(chǎn)生中和抗體，S蛋白的變異會導致致病性、免疫原性以及組織趨性的變化[16，17]。此外，S蛋白是協(xié)助病毒進入宿主細胞的重要結構蛋白，由S1和S2亞基組成，S1較S2更易發(fā)生突變[18，19]。因此，對HB201602的S1基因進行了序列測定，并從NCBI上選取了32株PEDV菌株，根據(jù)S1基因構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹將PEDV分為G1和G2型，其中G1細分為G1-a亞型（經(jīng)典毒株及其來源的疫苗毒株）、G1-b亞型（S-INDEL毒株），G2細分為G2-a亞型（變異毒株）、G2-b亞型（重組毒株）。通過分析PEDV毒株的分離時間，發(fā)現(xiàn)2011年后分離的毒株大多以G2型變異毒株為主。臨床分離毒株HB201602與AJ1102、YN15、YN30、YN4-9、XY2013、

BJ-2011-1、GD-1、CH-HXIDZ-1-2012等同屬于G2-a亞型（變異毒株）簇，親緣關系上與AJ1102和LC最為接近，而經(jīng)典毒株CV777位于G1-a分支上，提示HB201602為PEDV變異毒株。S1基因遺傳變異分析顯示，DR13-attenuated、PEDV-attenuated-vaccine等G1-b亞型毒株與其他簇毒株相比，在357-396位氨基酸處，存在9個特異的氨基酸突變（K357I359T359V361V366T367E368K381K396）。CV777、LZC等G1-a亞型經(jīng)典毒株與其他簇毒株相比，在524-552位氨基酸處，存在4個特異的氨基酸突變（L524S526V530T552）。這些氨基酸的突變可能導致S蛋白的構象和功能變化，進一步導致疫苗匹配度降低，造成免疫失敗，增加了PDEV預防和控制的難度。PDEV S蛋白的突變是否會引起免疫逃避，進而衍生更強毒力毒株的出現(xiàn)目前還不清楚，但對現(xiàn)階段中國流行毒株S1基因的變異分析，將有助于了解PEDV的遺傳變異趨勢，為新型疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 唐金明，陳書琨，林慶燕，等.豬流行性腹瀉病毒分離鑒定與實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2014，35（8）：31-35.

[2] 劉孝珍，陳建飛，時洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（3）：180-183.

[3] 陳建飛，馮 ?力，時洪艷，等.豬流行性腹瀉疫苗的研究[J].豬業(yè)科學，2010，27（12）：50-51.

[4] 付夢瑾，朱 ?玲，吳云飛，等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及增值規(guī)律[J].中國獸醫(yī)科學，2013，43（11）：1133-1139.

[5] SONG D，PARK B. Porcine epidemic diarrhoea virus：A comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines[J].Virus genes，2012，44（2）：167-175.

[6] LEE C. Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and re-emerging epizootic swine virus[J].Virol J，2015，12：193.

[7] STEVENSON G W，HOANG H，SCHWARTZ K J，et al. Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States：Clinical signs，lesions，and viral genomic sequences[J].J Vet Diagn Invest，2013，25：649-654.

[8] PARK S J，SONG D S，PARK B K. Molecular epidemiology and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） field isolates in Korea[J].Arch Virol，2013，158（7）：1533-1541.

[9] SHI P，SU Y，LI R，et al. PEDV nsp16 negatively regulates innate immunity to promote viral proliferation[J].Virus Res，2019，265：57-66.

[10] KAEWBORISUTH C，YINGCHUTRAKUL Y，ROYTRAKUL S，et al. Porcine epidemic diarrhea Virus （PEDV） ORF3 interactome reveals inhibition of virus replication by cellular VPS36 protein[J].Viruses，2019，11（4）：E382.

[11] CHANG S H，BAE J L，KANG T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J].Mol Cells，2002，14（2）：295-299.

[12] KANG T J，SEO J E，KIM D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants[J].Protein Expr Purif，2005，41（2）：378-383.

[13] SUN R，LENG Z，ZHAI S L，et al. Genetic variability and phylogeny of current Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains based on spike，ORF3，and membrane genes[J].Scientific world journal，2014：208439.

[14] SHIBATA I，TSUDA T，MORI M，et al. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages[J].Vet Microbiol，2000，72：173-182.

[15] WANG J，HUANG L，MOU C，et al. Mucosal immune responses induced by oral administration recombinant Bacillus subtilis expressing the COE antigen of PEDV in newborn piglets[J].Biosci Rep，2019，39（3）：BSR20182028.

[16] WANITCHANG A，SAENBOONRUENG J，KAEWBORISUTH C， et al. A single V672F substitution in the spike protein of field-isolated PEDV promotes cell-cell fusion and replication in VeroE6 cells[J].Viruses，2019，11（3）：282.

[17] YUAN L，ZHANG S，PENG J，et al. Synthetic surfactin analogues have improved anti-PEDV properties[J].PLoS one，2019，14（4）：e0215227.

[18] ZHAO P，WANG B，JI C M，et al. Identification of a peptide derived from the heptad repeat 2 region of the porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） spike glycoprotein that is capable of suppressing PEDV entry and inducing neutralizing antibodies[J].Antiviral Res，2018，150：1-8.

[19] DIEP N V，NORIMINE J，SUEYOSHI M，et al. Novel porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） variants with large deletions in the Spike （S） gene coexist with PEDV strains possessing an intact S gene in domestic pigs in Japan：A new disease situation[J].PLoS one，2017，12：e0170126.