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        氧化劑體外誘導(dǎo)對(duì)阿薩希毛孢子菌致病性影響的實(shí)驗(yàn)研究

        2019-02-05 04:03:42李海濤區(qū)敏儀敖俊紅楊蓉婭
        實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2019年5期
        關(guān)鍵詞:氧化劑懸液致病性

        李海濤,區(qū)敏儀,敖俊紅,祝 賀,楊蓉婭

        近30 多年以來(lái),隨著糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,以及惡性腫瘤、大面積燒傷、器官移植、血液病、艾滋病患者的日益增多,機(jī)會(huì)性真菌感染,特別是深部真菌感染的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì),已成為這些患者死亡的主要原因之一。除念珠菌病、曲霉病、隱球菌病等常見(jiàn)的真菌感染性疾病外,由非念珠菌屬酵母菌所致的真菌感染在免疫受損人群中日漸增多[1-4],特別是深部播散性感染者病情嚴(yán)重,病死率高。阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)作為毛孢子菌屬中最重要的臨床致病菌,可引起淺表皮膚感染、播散性系統(tǒng)性內(nèi)臟器官的感染以及夏季超敏性肺炎[5],其引起的深部侵襲性感染病死率達(dá)70%以上,近年來(lái)該病發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[2,3]。

        既往研究表明,病原微生物的抗宿主氧化殺傷與其致病性密切相關(guān),這一點(diǎn)在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見(jiàn)致病真菌的研究中已經(jīng)得到證實(shí)[6-8]。但是,關(guān)于T.asahii抗氧化殺傷方面的研究還非常少。本研究擬通過(guò)體外誘導(dǎo)的方式,將2 種氧化劑與T.asahii作菌株體外共培養(yǎng)進(jìn)行體外誘導(dǎo),將誘導(dǎo)前后的T.asahii菌株注入到有聯(lián)合免疫缺陷的裸鼠體內(nèi),觀察T.asahii被氧化劑誘導(dǎo)前后對(duì)動(dòng)物致病性的變化,為T.asahii感染與致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 阿薩希毛孢子菌共2 株,T.asahii標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479、環(huán)境株CBS8904 均購(gòu)自荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)學(xué)院真菌多樣性研究中心(CBS-KNAW)。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Balb/c 裸鼠(聯(lián)合免疫缺陷鼠)168 只,雌性,6 周齡,平均質(zhì)量30 g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF 級(jí)動(dòng)物室中。將小鼠分為7 組,CBS2479 組(菌株1)、CBS2479 H2O2誘導(dǎo)組(菌株2)、CBS2479 甲萘醌誘導(dǎo)組(菌株3),CBS8904 組(菌株4)、CBS8904 H2O2誘導(dǎo)組(菌株5)、CBS8904甲萘醌誘導(dǎo)組(菌株6),以及空白對(duì)照組(定為菌株7),每組24 只小鼠。再將每組分為4 個(gè)小組,每組6 只。

        1.1.3 主要試劑與儀器 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)干粉(德國(guó)默克公司),蛋白胨干粉和葡萄糖干粉(北京化學(xué)試劑有限公司),酵母粉(英國(guó)OXOID 公司),30%過(guò)氧化氫(美國(guó)Sigma 公司),亞硫酸氫鈉甲萘醌(美國(guó)Sigma 公司),二酰胺(美國(guó)Sigma 公司),YPD 液體培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司)

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1T.asahii菌株氧化劑體外誘導(dǎo) 制備經(jīng)傳代純化的單克隆T.asahiiCBS2479、CBS8904 的菌懸液,調(diào)整濃度為1~5×106CFU/ml,取100 μl 菌懸液加入10 ml 不含H2O2的YPD 培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)10 h 后加入H2O2,使其濃度達(dá)8 μg/ml(CBS2479、CBS8904 菌株的1/2MIC H2O2)后繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)菌液達(dá)到約0.5 麥?zhǔn)蠁挝粫r(shí)轉(zhuǎn)至同一H2O2濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng),每個(gè)濃度梯度轉(zhuǎn)種2~3 次。以同樣方法進(jìn)行下一濃度的培養(yǎng),直至H2O2或甲萘醌的誘導(dǎo)濃度達(dá)到64 μg/ml 或者菌株被殺死不再生長(zhǎng),即終止誘導(dǎo)。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

        1.2.2 各組T.asahii菌株菌懸液配制 將各組菌株傳代純化后的新鮮菌落接種于YPD 液體培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)48 h,取適量菌懸液,將YPD 培養(yǎng)基成分清洗干凈后,用生理鹽水分別配成濃度為1×105、1×106、1×107及1×108的菌懸液,分裝于2 ml 離心管中備用,空白對(duì)照組用生理鹽水替代菌懸液。

        1.2.3 各組菌株致病性測(cè)定 取各組小鼠尾靜脈,常規(guī)消毒后,向其尾靜脈注入上述4 個(gè)梯度濃度的菌懸液500 μl,觀察并記錄30 d 內(nèi)各組小鼠的死亡時(shí)間、死亡只數(shù),繪制生存曲線圖,并用SPSS20.0 按Bliss法計(jì)算出半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)[9,10]。(LD50=lg-1[Xn-i(2∑m+h/2n-0.75)],其中Xn 為最高反應(yīng)組的對(duì)數(shù)劑量,i 為組距,即等差數(shù)列的對(duì)數(shù)劑量的公差,m 為各組動(dòng)物反應(yīng)數(shù),∑m 各組動(dòng)物反應(yīng)數(shù)的總和,n 為每組動(dòng)物數(shù),h 為首末兩組動(dòng)物數(shù)的平均數(shù))比較它們的致病性差異。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS20.0 軟件分析,兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組T.asahii 菌株半數(shù)致死量測(cè)定結(jié)果

        菌株1(CBS2479 組),即CBS2479 未誘導(dǎo)組的LD50為7.2361×105,而H2O2誘導(dǎo)后的菌株2(CBS 2479-H2O2誘導(dǎo)組)的LD50為6.0139×105,甲萘醌誘導(dǎo)后的菌株3(CBS2479-甲萘醌誘導(dǎo)組)的LD50為 8.1802×104,誘導(dǎo)后菌株的LD50濃度明顯低于誘導(dǎo)前,其中甲萘醌誘導(dǎo)組,即菌株3 的LD50濃度低于未誘導(dǎo)組——菌株1(CBS2479 組)1 個(gè)數(shù)量級(jí)(約10 倍),H2O2誘導(dǎo)組的LD50濃度則比未誘導(dǎo)組——菌株1 低了1.2 倍。菌株4(CBS8904 組),即CBS8904 未誘導(dǎo)組的LD50為8.9643×107,而H2O2誘導(dǎo)后的菌株5(CBS8904-H2O2誘導(dǎo)組)的LD50為4.0437×107,甲萘醌誘導(dǎo)后的菌株6(CBS8904-甲萘醌誘導(dǎo)組)的LD50為1.8971×106,誘導(dǎo)后菌株的LD50濃度也明顯低于誘導(dǎo)前。其中菌株6 的LD50濃度低于未誘導(dǎo)組——菌株4(CBS8904 組)1.5 個(gè)數(shù)量級(jí)(約47 倍),菌株5 的LD50濃度則比未誘導(dǎo)組——菌株4 低了2 倍(表1)。

        2.2 各組小鼠生存率比較

        氧化劑誘導(dǎo)后的臨床株菌株3(CBS2479-甲萘醌誘導(dǎo)組)和菌株2(CBS2479-H2O2誘導(dǎo)組)接種的小鼠分別在第9 天、第11 天全部死亡,生存率為0;而未誘導(dǎo)的菌株1(CBS2479 組)接種的小鼠在第9 天時(shí)有50%存活,生存率為50%,第11 天時(shí)生存率降低為10%,但是之后再?zèng)]有小鼠死亡。氧化劑誘導(dǎo)后的環(huán)境株菌株6(CBS8904-甲萘醌誘導(dǎo)組)和菌株5(CBS8904 -H2O2誘導(dǎo)組),接種的小鼠在第11 天的生存率分別20%和60%,而未誘導(dǎo)的菌株4(CBS8904組)接種的小鼠,在第6 天時(shí)生存率是70%,第6 天之后,一直到觀察終點(diǎn)(第30 天)所有小鼠均存活,沒(méi)有死亡。空白對(duì)照組所有小鼠在觀察期內(nèi)全部存活,生存率為100%(圖1)。

        3 討論

        隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素的普遍使用,以及器官移植術(shù)、侵入性介入技術(shù)的普及,條件致病真菌感染的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。病原體微生物(包括細(xì)菌、真菌和病毒等)侵入人體后,誘導(dǎo)人體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。吞噬細(xì)胞是人體抵抗其感染的第一道防線,釋放大量活性氧遞質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)來(lái)殺滅病原體[11,12]。病原微生物為了生存,會(huì)啟動(dòng)自身的一系列抗氧化機(jī)制,來(lái)對(duì)抗機(jī)體的氧化殺傷,為它們的侵襲感染和致病創(chuàng)造條件,因此,病原微生物的抗氧化機(jī)制與其致病性密切相關(guān),這一點(diǎn)在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見(jiàn)致病真菌的研究中已經(jīng)得到證實(shí)[6-8],但T.asahii在這一領(lǐng)域的研究還比較少。

        Zong 等[13]研究發(fā)現(xiàn),H2O2、甲萘醌、二酰胺可對(duì)T.asahii產(chǎn)生不同程度的氧化殺傷作用。Zhang等[14]也發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源T.asahii的抗氧化酶過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性不同,提示T.asahii也具有抗氧化防御機(jī)制。區(qū)敏儀等[15]通過(guò)2 種氧化劑體外誘導(dǎo)的方式成功獲得了T.asahii體外抗氧化菌株,并對(duì)誘導(dǎo)前后菌株的藥物敏感性和生物學(xué)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后T.asahii的藥物敏感性明顯降低,MIC值顯著上升,菌株的肉眼形態(tài)和光鏡下形態(tài)均有明顯變化。

        本研究主要通過(guò)體外誘導(dǎo)的方式獲得誘導(dǎo)前后T.asahii菌株,再將誘導(dǎo)前后的T.asahii菌株注射到聯(lián)合免疫缺陷鼠體內(nèi),觀察小鼠的死亡情況,對(duì)誘導(dǎo)前后T.asahii菌株的致病性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株1(CBS2479 組),即CBS2479 未誘導(dǎo)組的LD50為7.2361×105,而H2O2誘導(dǎo)后的菌株2(CBS2479-H2O2誘導(dǎo)組)的LD50為6.0139×105,甲萘醌誘導(dǎo)后的菌株3(CBS2479-甲萘醌誘導(dǎo)組)的LD50為 8.1802×104,誘導(dǎo)后菌株的LD50濃度明顯低于誘導(dǎo)前,其中甲萘醌誘導(dǎo)組,即菌株3 的LD50濃度低于未誘導(dǎo)組——菌株1(CBS2479 組)1 個(gè)數(shù)量級(jí)(約10 倍),H2O2誘導(dǎo)組的LD50濃度則比未誘導(dǎo)組——菌株1 低了1.2 倍。菌株4(CBS8904 組),即CBS8904 未誘導(dǎo)組的LD50為8.9643×107,而H2O2誘導(dǎo)后的菌株5(CBS8904 H2O2-誘導(dǎo)后組)的LD50 為 4.0437×107,甲萘醌誘導(dǎo)后的菌株6(CBS8904——甲萘醌誘導(dǎo)后組)的LD50為1.8971×106,誘導(dǎo)后菌株的LD50濃度也明顯低于誘導(dǎo)前。其中菌株6 的LD50濃度低于未誘導(dǎo)組——菌株4(CBS8904 組)1.5 個(gè)數(shù)量級(jí)(約47 倍),菌株5 的LD50濃度則比未誘導(dǎo)組——菌株4低了2 倍。研究結(jié)果提示,2 種氧化劑誘導(dǎo)后,無(wú)論是臨床株CBS2479,還是環(huán)境株CBS8904,其致病性均顯著上升,其中環(huán)境株CBS8904 受氧化劑誘導(dǎo)后,其致病性比臨床株CBS2479 升高的更明顯,但是環(huán)境株CBS8904 三組的整體LD50的濃度高于臨床株CBS2479 一個(gè)數(shù)量級(jí),提示環(huán)境株CBS8904 經(jīng)氧化劑誘導(dǎo)后,其致病性雖顯著升高,但是其致病能力仍低于臨床株CBS2479。分析原因可能為,CBS 8904 三組是體外氧化劑誘導(dǎo)組,只有氧化劑一個(gè)單一因素,氧化劑體外誘導(dǎo),雖能模仿體內(nèi)環(huán)境,但和機(jī)體內(nèi)環(huán)境仍然有較大差異。而臨床株CBS2479 是從人體分離出來(lái)的致病菌,其與人體相互作用機(jī)制復(fù)雜,除了抗氧化機(jī)制之外,還有其他機(jī)制參與其中,不是單純的體外誘導(dǎo)能完全模擬的。

        表1 各組T.asahii的半數(shù)致死量(LD50)比較

        圖1 各組菌株動(dòng)物致病性比較

        本研究對(duì)接種至裸鼠的7 株菌致病性進(jìn)行了觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氧化劑誘導(dǎo)后的臨床株菌株3(CBS2479-甲萘醌誘導(dǎo)組)和菌株2(CBS2479-H2O2誘導(dǎo)組)的致病性顯著升高,兩組菌株接種后的小鼠分別在第9 天、第11 天全部死亡,生存率是0;而未誘導(dǎo)的菌株1(CBS2479 組)接種后的小鼠在第9天時(shí)有50%存活,生存率是50%,第11 天時(shí)生存率降低為10%,但是之后再無(wú)小鼠死亡。

        氧化劑誘導(dǎo)后的環(huán)境株菌株6(CBS8904-甲萘醌誘導(dǎo)組)和菌株5(CBS8904 H2O2-誘導(dǎo)組)接種的小鼠在第11 天的生存率分別為20%和60%,而未誘導(dǎo)的菌株4(CBS8904 組)接種的小鼠在第6 天時(shí)生存率是70%,第6 天之后,一直到觀察終點(diǎn)(第30 天)所有小鼠均存活,沒(méi)有死亡。空白對(duì)照組所有小鼠在觀察期內(nèi)全部存活,生存率為100%。從生存曲線圖可以看到,經(jīng)氧化劑誘導(dǎo)后的菌株致病性明顯增強(qiáng),小鼠生存率顯著降低。對(duì)2 種氧化劑誘導(dǎo)后的菌株致病性比較發(fā)現(xiàn),甲萘醌誘導(dǎo)后T.asahii菌株,無(wú)論是臨床株,還是環(huán)境株,其致病性均高于相應(yīng)H2O2誘導(dǎo)的菌株,而且氧化劑誘導(dǎo)后的T.asahii菌株,無(wú)論是甲萘醌誘導(dǎo)的,還是H2O2誘導(dǎo)的,臨床株(CBS2479)的致病性也高于環(huán)境株(CBS8904)。本課題組Zong 等[13]前期的研究也發(fā)現(xiàn),H2O2、甲萘醌、二酰胺均可對(duì)T.asahii產(chǎn)生不同程度的氧化殺傷作用,但甲萘醌殺傷作用最強(qiáng),二酰胺次之,H2O2最弱,說(shuō)明甲萘醌的氧化殺傷作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比H2O2強(qiáng)。因此,筆者分析,由甲萘醌體外誘導(dǎo)的T.asahii菌株的致病性要高于由H2O2體外誘導(dǎo)的T.asahii菌株,可能由于甲萘醌的氧化殺傷作用比H2O2更強(qiáng),因而由它誘導(dǎo)出來(lái)的T.asahii菌株抗氧化能力則更強(qiáng),但具體機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

        總之,本研究通過(guò)應(yīng)用2 種氧化劑H2O2和甲萘醌在體外分別對(duì)T.asahii臨床株和環(huán)境株進(jìn)行誘導(dǎo),觀察誘導(dǎo)前后菌株的致病性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后菌株致病性顯著高于誘導(dǎo)前,而甲萘醌誘導(dǎo)的菌株致病性高于H2O2誘導(dǎo)菌株,本研究從一個(gè)角度證明了T.asahii菌株對(duì)機(jī)體的感染或致病機(jī)制有抗氧化機(jī)制的參與,下一步將從組學(xué)的角度對(duì)T.asahii感染人體的抗氧劑機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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