王新立，劉汝銀，王西彬，岳宗進(jìn)

河南省中醫(yī)院脊柱科 鄭州 450000

下腰痛是臨床上的常見病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。研究[2]顯示半數(shù)以上的下腰痛由椎間盤退行性病變?cè)斐伞．?dāng)椎間盤發(fā)生退行性病變時(shí)，髓核中的胞外基質(zhì)降解且不能及時(shí)更新，導(dǎo)致椎間盤的生物力學(xué)特性發(fā)生變化，進(jìn)而影響脊柱的穩(wěn)定性[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)多種因素與椎間盤退行性病變的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如氧化應(yīng)激、炎癥和抽煙等。當(dāng)歸是一種常見中藥，具有明顯的抗炎和抗氧化活性[5-6]。研究[7]顯示當(dāng)歸用于治療腰椎間盤突出癥療效顯著，且當(dāng)歸能夠抑制髓核細(xì)胞的凋亡和自噬。但是當(dāng)歸對(duì)髓核細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用尚未見相關(guān)研究。因此我們使用H2O2處理體外培養(yǎng)的大鼠髓核細(xì)胞，模擬氧化應(yīng)激環(huán)境，探究當(dāng)歸對(duì)氧化應(yīng)激損傷的髓核細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)合成的影響和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料大鼠椎間盤髓核細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，具體分離方法見文獻(xiàn)[7]。當(dāng)歸注射液購(gòu)于雅安三九藥業(yè)有限公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，胎牛血清、胰蛋白酶和青/鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，MTT試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司，H2O2溶液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，RNAiso Plus購(gòu)于大連寶生物有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和UltraSYBR Mixture(with ROX Ⅰ)購(gòu)于北京康為世紀(jì)有限公司，Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3和c-Myc抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，蛋白聚糖(Aggrecan)抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)、MMP9、β-catenin及β-actin抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的髓核細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青/鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加任何干預(yù))、H2O2組(加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)、H2O2+當(dāng)歸組(先加入1 g/L當(dāng)歸溶液培養(yǎng)24 h，然后加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)。

1.3細(xì)胞活力檢測(cè)收集分組處理的髓核細(xì)胞，使用MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL Formazan溶解液，充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，直至紫色結(jié)晶全部溶解。在570 nm波長(zhǎng)處，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，代表細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

1.4PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot法。收集分組處理的髓核細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)其濃度。取40 μg總蛋白，沸水浴煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離蛋白。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h后，加入一抗(PCNA和CyclinD1抗體，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育，1×TBST充分洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后，將ECL發(fā)光液均勻加至膜上，拍照，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度值分析。

1.5Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA表達(dá)的檢測(cè)按照RNAiso Plus試劑說(shuō)明書操作，提取各組細(xì)胞的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用NanoDrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按照UltraSYBR Mixture說(shuō)明書加入各試劑，進(jìn)行Real-time PCR操作。反應(yīng)體系：UltraSYBR Mixture 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3、MMP9蛋白及β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot法。方法同1.4，其中Aggrecan、MMP3、c-Myc抗體稀釋度均為1∶1 000，Collagen Ⅱ、MMP9、β-catenin抗體稀釋度分別為1∶500、1∶800、1∶1 200。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組以上各指標(biāo)的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞活力、PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞活力降低，PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低；與H2O2組相比，H2O2+當(dāng)歸組細(xì)胞活力增加，PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高。見圖1、表2。

1、2、3：分別為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+當(dāng)歸組

組別細(xì)胞活力/%PCNACyclinD1對(duì)照組103.333±10.0331.328±0.1281.068±0.089H2O2組49.167±10.722*0.410±0.093*0.156±0.069*H2O2+當(dāng)歸組87.833±9.745#0.920±0.084*#0.606±0.107*#F45.100 119.614 128.734 P<0.001 <0.001 <0.001

*:與對(duì)照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

2.2各組細(xì)胞Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA及蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，H2O2組Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,MMP3和MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；當(dāng)歸可部分逆轉(zhuǎn)H2O2引起的變化。見表3、圖2、表4。

表3 各組細(xì)胞Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP3和MMP9 mRNA的表達(dá)(n=3)

*:與對(duì)照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

1、2、3：分別為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+當(dāng)歸組

組別AggrecanCollagen ⅡMMP3MMP9對(duì)照組1.353±0.0651.007±0.1030.050±0.0300.110±0.036H2O2組0.400±0.110*0.367±0.129*1.710±0.115*1.143±0.090*H2O2+當(dāng)歸組0.973±0.097*#0.827±0.087#0.930±0.088*#0.643±0.131*#F80.450 28.172 280.887 90.806 P<0.001 0.001 <0.001 <0.001

*:與對(duì)照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

2.3各組細(xì)胞β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，H2O2組β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平升高；與H2O2組相比，H2O2+當(dāng)歸組β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平降低。見圖3和表5。

1、2、3：分別為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+當(dāng)歸組

組別β-cateninc-Myc對(duì)照組0.053±0.0350.410±0.095H2O2組0.987±0.100*1.267±0.139*H2O2+當(dāng)歸組0.520±0.090*#0.620±0.090#F101.205 49.247 P<0.001 <0.001

*:與對(duì)照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

由增殖降低引起的基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的減少是椎間盤退行性病變的一個(gè)重要因素[8]。PCNA和CyclinD1是兩個(gè)重要的細(xì)胞增殖標(biāo)志物[9]。本研究中H2O2刺激抑制了髓核細(xì)胞的活力，降低了PCNA和CyclinD1的表達(dá)。當(dāng)歸預(yù)處理明顯增加了H2O2刺激的髓核細(xì)胞的活力，上調(diào)了PCNA和CyclinD1的表達(dá)，表明當(dāng)歸能夠促進(jìn)氧化損傷的髓核細(xì)胞增殖。

研究[10]顯示，椎間盤中胞外基質(zhì)的組成對(duì)于其功能的維持至關(guān)重要，胞外基質(zhì)的降解會(huì)導(dǎo)致椎間盤高度的減小以及血管和神經(jīng)數(shù)目的減少。髓核細(xì)胞負(fù)責(zé)椎間盤中胞外基質(zhì)的合成和調(diào)控，控制胞外基質(zhì)合成與降解的平衡。髓核細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)主要為Aggrecan和Collagen Ⅱ。MMPs能夠介導(dǎo)基質(zhì)的降解過(guò)程，在椎間盤退行性病變中MMP1、MMP3、MMP7、MMP9和MMP13的表達(dá)和活性均增加[10]。此外，研究[11-12]發(fā)現(xiàn)在髓核細(xì)胞中MMPs表達(dá)上調(diào)會(huì)引起Aggrecan和Collagen Ⅱ含量的下降。因此，本研究使用H2O2誘導(dǎo)髓核細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，探究當(dāng)歸對(duì)髓核細(xì)胞中胞外基質(zhì)合成的影響和分子機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2處理后髓核細(xì)胞中Aggrecan和Collagen Ⅱ的表達(dá)均下調(diào)，而MMP3和MMP9的表達(dá)均上調(diào)。這表明H2O2抑制了髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)了其降解，與之前的研究[13]結(jié)果相一致。與H2O2組相比，當(dāng)歸預(yù)處理增加了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表達(dá)，下調(diào)了MMP3和MMP9的表達(dá)，這表明當(dāng)歸能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞中胞外基質(zhì)的合成，減少其降解。

Wnt/β-catenin通路的活化與椎間盤退行性疾病的發(fā)展密切相關(guān)。該通路能夠加速髓核細(xì)胞的衰老，誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)，促進(jìn)胞外基質(zhì)的降解[14]。c-Myc是Wnt/β-catenin通路下游的一個(gè)重要靶基因[15]。本研究結(jié)果顯示，H2O2刺激后髓核細(xì)胞β-catenin和c-Myc的表達(dá)水平均增加，而使用當(dāng)歸預(yù)處理后髓核細(xì)胞β-catenin和c-Myc的表達(dá)水平均降低，提示當(dāng)歸可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和胞外基質(zhì)的合成。