趙小雙,楊海波,趙蔭濤,劉 源

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內科 鄭州 450052

心室重構是引起心力衰竭的主要機制之一，貫穿整個心力衰竭的發(fā)展。在心室重構的演化過程中，心肌細胞中TLR4/NF-κB信號通路被激活并轉錄入核，誘導相關的下游炎癥因子(IL-6、IL-1等)的轉錄及翻譯，進而加速心肌細胞凋亡、間質纖維化。而細胞凋亡在心室重構晚期發(fā)揮著不可或缺的角色，極大地促進心室重構的發(fā)生及發(fā)展，因此抑制細胞凋亡可有效地逆轉心室重構的進展[1]。但目前臨床尚無特異性抑制心肌細胞凋亡的靶向藥物，因此尋找可有效地逆轉心室重構的靶向藥物顯得尤為重要。山奈酚歸屬于黃酮類化合物，主要存在于姜科植物山奈的根莖，也可見于各種水果、蔬菜中。有研究[2-3]結果提示，其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用。還有研究[4]結果顯示，山奈酚具有抗心肌細胞肥大及間質纖維化的作用，但其對心肌細胞凋亡的作用尚不明確。因此本研究就山奈酚對心肌細胞凋亡的作用做進一步的探討，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器山奈酚購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司(貨號520-18-3，分子式C15H10O6，純度>99.9%，檢測途徑為高效液相色譜法)。取7.16 mg山奈酚溶解于1 mL DMSO中配制成實驗所用的母液(25 mmol/L)，實驗過程中DMSO在培養(yǎng)液中的體積分數低于0.02%。DMEM基礎培養(yǎng)基、新生小牛血清、雙抗(PS)、CCK-8試劑盒均購自日本同仁化學研究所，胰蛋白酶購自Gibco公司， DAPI購自ThermoFisher公司，抗體購自Cell Signaling Technology公司，LPS購自Sigma公司。恒溫培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司，DP72倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，多功能微孔板檢測系統(tǒng)Synergy HT購自美國BioTek公司。

1.2細胞培養(yǎng)大鼠H9c2細胞購自中科院上海細胞庫。培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基成分為：DMEM基礎培養(yǎng)基+體積分數10%小牛血清+體積分數1% PS。細胞培養(yǎng)于37 ℃恒溫、體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱中，當細胞鋪滿80%的培養(yǎng)皿底(密度2×105個/mL)時，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化后進行傳代。在對細胞進行處理之前，將培養(yǎng)細胞所用的基礎培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基(DMEM基礎培養(yǎng)基+體積分數0.5% PS)，接著饑餓處理18 h，饑餓處理可減少血清對刺激因素的影響，同時可使所有細胞處于同步化。

1.3細胞活性檢測采用CCK-8法進行檢測。實驗分為2組：山奈酚組(0、5、25、50 μmol/L山奈酚處理組)和LPS+山奈酚組(10 mg/L LPS+0、5、25、50 μmol/L山奈酚處理組)，另設只加培養(yǎng)基和CCK-8溶液的空白對照、只加細胞和CCK-8溶液的陰性對照。首先將細胞接種到96孔板中，為提高實驗準確性需保證每孔100 μL，且密度約維持在2×105個/mL，然后置于溫箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，再用無血清培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，進行18 h的饑餓處置，最后采用不同濃度山奈酚和(或)LPS處理12 h，將96孔板中的培養(yǎng)基再次換為含有10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μL，在恒溫箱中繼續(xù)孵育2.0～2.5 h后，將其置于酶標儀下(波長450 nm)分別檢測每孔的吸光度(A)值，計算細胞活力，細胞活力=[(藥物組A值-空白對照A值)/(陰性對照A值-空白對照A值)]×100%，繪制曲線。實驗重復3次。

1.4細胞凋亡的檢測實驗分為3組：對照、單加10 mg/L LPS和10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。培養(yǎng)細胞在胰蛋白酶消化后調整密度為1×105個/mL，制作細胞爬行片，并進行饑餓培養(yǎng)18 h，后加入不同濃度山奈酚和(或)LPS處理細胞12 h，用PBS漂洗3次，再用10 g/L多聚甲醛進行固定10 min，接著用體積比2∶1乙醇/乙酸混合液在-20 ℃恒溫下固定5 min，再次用PBS清洗3 min。加入平衡液室溫下孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液振蕩15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液體，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，進行避光孵育約30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。正常的細胞核可被染為藍色，而凋亡的細胞核則被染為綠色，每組選擇8個視野(×400)，記錄凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。實驗重復8次，取其平均值。

1.5Westernblot檢測H9c2細胞凋亡相關蛋白及TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達實驗分為5組：對照、單加10 mg/L LPS、10 mg/L LPS+5 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+25 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。在冰上裂解細胞10 min，然后將其置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz進行10～15 s的裂解，4 ℃ 12 000×g離心15 min，上清液移至離心管中，BCA定量檢測蛋白濃度并加入相同質量的蛋白于200 mL EP中進行高溫變性。在每組樣本混合均勻后取10 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳，將GAPDH設置為內參，然后依據各樣本的光密度值逐個調整上樣劑量，再次對調整后的上樣劑量進行凝膠電泳檢測，使各樣本間GAPDH的光密度值無差異，緊接著對每組以校正后的上樣劑量分別進行凝膠電泳檢測，將蛋白以200 mA、90 min的參數移到PVDF膜上，并使用一抗封閉液進行封閉12 h，其中一抗包括p-Iκbα、p-P65、cleaved Caspase(c-Caspase)-8、P65、c-Caspase-3、Iκbα、c-Caspase-9，封閉12 h后使用TBST清洗3次，接著放入對應的加有二抗的稀釋液中進行避光孵育1 h，其中二抗為山羊抗兔IgG抗體，孵育結束后再用TBST清洗3次，并將其放入Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀中檢測目的條帶，同時應用Gel-Pro Application圖像分析軟件檢測各組蛋白的光密度值，以代表其蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。不同組間細胞凋亡率、凋亡相關蛋白相對表達量及TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1山奈酚對H9c2細胞活性的影響結果見圖1。

2.2山奈酚對LPS誘導下H9c2細胞凋亡的影響結果見圖2、表1。

圖1 山奈酚對H9c2細胞活性的影響

A:對照組；B:LPS組；C：LPS+山奈酚組

表1 各組細胞凋亡率比較 %

F=412.690，P<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

2.3山奈酚對LPS誘導H9c2細胞凋亡相關蛋白表達的影響結果見圖3、表2?？芍琇PS可提高c-Caspase-8、c-Caspase-9、c-Caspase-3蛋白表達水平，不同濃度山奈酚可抑制上述凋亡相關蛋白的表達。

1：對照組；2：LPS組；3：LPS+5 μmol/L山奈酚組；4：LPS+25 μmol/L山奈酚組；5：LPS+50 μmol/L山奈酚組

圖3 各組細胞中凋亡相關蛋白的表達

*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

2.4山奈酚對LPS誘導H9c2細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的影響結果見圖4、表3?？芍?，不同濃度山奈酚可抑制LPS誘導的TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達。

1：對照組；2：LPS組；3：LPS+5 μmol/L山奈酚組；4：LPS+25 μmol/L山奈酚組；5：LPS+50 μmol/L山奈酚組

圖4 各組細胞TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達

*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

3 討論

該研究結果顯示，和對照組相比，山奈酚可明顯改善LPS引起的H9c2細胞活性降低，減少凋亡的發(fā)生，并且這種效應可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化從而發(fā)揮作用的，提示山奈酚可發(fā)揮抗心肌細胞炎癥的作用，為臨床治療心肌炎提供了實驗依據。有研究[5-6]證實，LPS可直接作用于心肌細胞產生TNF-α等炎性因子，這些炎性因子可刺激心肌細胞發(fā)生凋亡，同時可作用于成纖維細胞誘發(fā)心肌纖維化,從而加重心功能不全，在心肌損傷到心力衰竭的疾病進程中發(fā)揮促進作用。因此，如果能抑制LPS引起的心肌細胞炎癥反應及凋亡，則可明顯改善并預防心功能不全，從而改善患者的生存預后和生活質量。

山奈酚歸屬黃酮類化合物，主要存在于姜科植物山柰的根莖，也可見于各種水果、蔬菜中，生活中多食用富含山奈酚的食物可降低多種疾病的發(fā)病率，其具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、抗菌的功效。既往研究顯示，其具有抗動脈粥樣硬化[7]、改善內皮功能作用，亦能改善體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷[8]以及阿霉素誘導的心肌細胞損傷[9]。但山奈酚對LPS誘導的H9c2細胞凋亡的作用國內外尚無報道，因此作者選擇了山奈酚作為一種新的抗心肌炎癥藥物進行進一步的研究。

既往研究[10-13]顯示，心肌細胞凋亡在心血管疾病(心肌炎、缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、心力衰竭等)發(fā)展的不同階段扮演不同的角色，在疾病早期可發(fā)揮一定的代償作用，但隨著疾病的進展，心肌細胞凋亡增多，可促進疾病的進展。心肌細胞在受到長期持續(xù)的炎癥刺激后，細胞凋亡增多，誘發(fā)心室重構并發(fā)生類似擴張型心肌病樣改變。因此，降低心肌細胞凋亡率可有效地抑制心室重構，改善心室重構的發(fā)生及發(fā)展。該研究結果顯示，細胞經過不同干預因素處理12 h后，對照組凋亡率為(6.7±0.9)%；LPS組可顯著增加H9c2細胞的凋亡率[(41.2±4.7)%]；LPS+山奈酚組的凋亡率則降低為(10.0±1.3)%?？梢?，山奈酚可顯著降低LPS誘導的心肌細胞凋亡率，提示山奈酚具有抗心肌細胞凋亡作用，進而發(fā)揮心血管保護作用。

作者進一步研究了山奈酚發(fā)揮細胞保護作用的機制。NF-κB是一類經典的炎癥信號分子，在心肌細胞炎癥反應的病理過程中，NF-κB持續(xù)活化可介導炎癥相關基因的轉錄，炎癥因子又可作用于細胞膜本身的炎性因子受體，從而誘導內源性及外源性凋亡通路的活化發(fā)揮促凋亡作用[14-15]。在本研究中，作者發(fā)現山奈酚可顯著抑制TLR4蛋白的表達，抑制Iκbα及P65的磷酸化，從而抑制NF-κB的核轉位。因此，山奈酚可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路從而發(fā)揮抗H9c2細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現山奈酚可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路從而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用，為山奈酚的臨床應用提供了一定的證據。