劉春華，王俊軼，銀 春，張 艷，姜 琪

1)四川綿陽四〇四醫(yī)院呼吸內(nèi)科 四川綿陽 621000 2)成都市第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 成都 610031

肺癌是常見的肺部惡性腫瘤，根據(jù)組織病理學(xué)特性將其分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占80%～85%。近年來，肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率一直呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-2]。上皮特異性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)屬于黏附分子家族的單次跨膜糖蛋白，在大腸癌、前列腺癌和胃癌等多種人類腫瘤組織中異常表達(dá)，通過調(diào)控相關(guān)信號通路或靶基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、黏附、侵襲和遷移等過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-5]。有研究[6-7]指出，高表達(dá)EpCAM與肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良關(guān)系密切，其可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，EpCAM在NSCLC中的作用尚不清楚，本研究通過觀察EpCAM在3種NSCLC細(xì)胞株H226、A549和PC-9中的表達(dá)，并構(gòu)建EpCAM低表達(dá)的A549細(xì)胞，從細(xì)胞水平上探討EpCAM對NSCLC細(xì)胞增殖及侵襲的影響，以期為NSCLC的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞、肺鱗癌H226細(xì)胞、肺腺癌A549細(xì)胞、肺腺癌PC-9細(xì)胞均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，青/鏈霉素、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購于上海碧云天公司，脫脂奶粉購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， ECL超敏發(fā)光液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。EpCAM抗體、β-actin抗體、Ki-67抗體、MMP-9抗體和HRP-羊抗兔/鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。EpCAM shRNA慢病毒顆粒和對照shRNA慢病毒顆粒購于美國Santa Cruz公司。qRT-PCR試劑盒購于美國MBI Fermentas公司，PCR引物購于上海吉瑪生物公司。Transwell小室、PVDF膜購于美國Millpore公司，Matrigel膠購于美國BD公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀購于美國Thermo Scientific公司，轉(zhuǎn)印電泳儀、多功能凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，分光光度計購于北京凱奧公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)采用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 g/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基接種BEAS-2B細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞H226、A549、PC-9，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)換液(每3 d一次)和傳代(每周2次)后，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3BEAS-2B、H226、A549和PC-9細(xì)胞EpCAMmRNA表達(dá)的檢測采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測。取收集到的對數(shù)生長期BEAS-2B、H226、A549和PC-9細(xì)胞，加入Trizol試劑提取總蛋白，分光光度計對所提總蛋白進(jìn)行濃度和純度的檢測。EpCAM上游引物5’-TGCTCTGAGCGAGTGAGAA-3’，下游引物5’-TGCAGTCCGCAAACTTTTA-3’； 內(nèi)參β-actin上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取2 μL cDNA，加入10 μL Mix、各1 μL上下游引物和6 μL ddH2O 配制反應(yīng)體系。經(jīng)離心將20 μL反應(yīng)體系混勻后，放入PCR儀中，設(shè)置PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(40個循環(huán))；72 ℃ 8 min。采用2-ΔΔCt法計算EpCAM mRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.4BEAS-2B、H226、A549和PC-9細(xì)胞EpCAM蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法進(jìn)行檢測。收集對數(shù)生長期的BEAS-2B、H226、A549和PC-9細(xì)胞，分別根據(jù)總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒提取和檢測總蛋白。取總蛋白50 g，加入4×蛋白上樣緩沖液混合后于沸水浴中5 min變性，行120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳。上樣后先以90 V電泳30 min，改換120 V電泳90 min結(jié)束分離總蛋白，再以30 V電壓轉(zhuǎn)膜90 min。將含有蛋白的PVDF膜浸泡于50 g/L脫脂奶粉封閉液2 h。加入EpCAM抗體(1∶200)和β-actin抗體(1∶1 000)，于4 ℃條件下反應(yīng)24 h。經(jīng)TBST漂洗后，加入HRP-羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶6 000)，常溫反應(yīng)1 h。以ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析EpCAM 蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.5A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果評價取24孔細(xì)胞板，以每孔3.5×105個細(xì)胞接種，將A549細(xì)胞分為對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時，進(jìn)行慢病毒感染。分別向EpCAM干擾組和陰性對照組培養(yǎng)液中加入EpCAM shRNA和對照shRNA慢病毒懸液，對照組中加入等體積培養(yǎng)液。充分混勻后，孵育24 h。以1 mL完全培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液后，孵育24 h。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以2 mg/L嘌呤霉素重懸細(xì)胞，以適當(dāng)濃度種植于96孔板上，每3 d更換培養(yǎng)液(含嘌呤霉素)，確認(rèn)克隆形成后，篩選幾個克隆，參照1.3和1.4中的方法檢測各組細(xì)胞中EpCAM mRNA和蛋白的表達(dá)情況，以評價其轉(zhuǎn)染效果。

1.6A549細(xì)胞增殖能力檢測采用CCK-8法進(jìn)行檢測。收集對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以每孔200 μL(細(xì)胞密度為3×104個/mL)種植到96孔板上。于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照1.5中方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每組各設(shè)5個平行孔，實驗重復(fù)3次。按照實驗要求培養(yǎng)24、48和72 h后，加入CCK-8溶液20 μL，反應(yīng)2.5 h后，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在570 nm處的光密度(OD)值。

1.7A549細(xì)胞克隆形成能力檢測采用細(xì)胞平板克隆實驗進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，按照1.5中的分組處理細(xì)胞后，以胰蛋白酶消化制備密度為3×104個/mL的細(xì)胞懸液，以每皿5 mL接種至培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)條件培養(yǎng)10 d(形成肉眼可見細(xì)胞集落)。棄上清后，以磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞。采用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%結(jié)晶紫染色，各30 min。沖洗染色液后，晾干。在顯微鏡低倍鏡下選取5個視野，觀察并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.8A549細(xì)胞侵襲能力檢測采用Transwell小室進(jìn)行檢測。將對照組、陰性對照組和EpCAM 干擾組A549細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基配制成密度為3×104個/mL的細(xì)胞懸液。取Transwell小室，以50 μL Matrigel溶液包被聚碳酸酯微孔膜，常溫下聚合30 min。下室中每孔加入100 μL含血清的完全培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞，按照每室100 μL加入上室，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)30 h。以棉簽小心擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，常溫下甲醛固定，結(jié)晶紫染色，各15 min。顯微鏡下選取5個200倍視野，統(tǒng)計穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.9A549細(xì)胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法進(jìn)行檢測。收集對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組A549細(xì)胞，經(jīng)提取總蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入特異性一抗Ki-67抗體(1∶800)、MMP-9抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)，反應(yīng)過夜后，再加入二抗。顯影曝光后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。BEAS-2B細(xì)胞及3種NSCLC細(xì)胞間EpCAM蛋白和mRNA相對表達(dá)量的比較，對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組間EpCAM mRNA、EpCAM蛋白、Ki-67蛋白、MMP-9蛋白相對表達(dá)量以及OD值、細(xì)胞克隆數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EpCAM在BEAS-2B細(xì)胞及3種NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)及其在A549細(xì)胞中的干擾效果結(jié)果見圖1和表1。與正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，A549、H226和PC-9細(xì)胞中EpCAM蛋白和mRNA表達(dá)均升高，并且3種NSCLC細(xì)胞中EpCAM蛋白和mRNA的表達(dá)水平依次為A549>PC-9>H226。因此，選用A549細(xì)胞開展后期實驗。對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組中EpCAM mRNA的相對表達(dá)量分別為(1.00±0.12)、(1.02±0.08)和(0.21±0.02)(F=90.609，P<0.001)；EpCAM 蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.62±0.07)、(0.54±0.05)和(0.10±0.01)(F=94.080，P<0.001)。與對照組相比，陰性對照組中EpCAM mRNA和蛋白的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但EpCAM干擾組中EpCAM mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。

圖1 EpCAM在BEAS-2B細(xì)胞、3種NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)(A)及其在A549細(xì)胞中的干擾效果(B)

*：與BEAS-2B細(xì)胞相比，P<0.05；#：與H266細(xì)胞相比，P<0.05；△：與PC-9細(xì)胞相比，P<0.05

2.2干擾EpCAM表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表2。與對照組相比，陰性對照組A549細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義；EpCAM干擾組A549細(xì)胞OD值與對照組相比均降低。

表2 各組A549細(xì)胞OD值比較(n=3)

*：與其他2組相比，P<0.05

2.3干擾EpCAM表達(dá)對A549細(xì)胞克隆形成和侵襲能力的影響結(jié)果見表3。與對照組相比，陰性對照組中細(xì)胞克隆數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，干擾EpCAM表達(dá)能夠減少細(xì)胞克隆數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)。

表3 各組A549細(xì)胞克隆數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

*：與其他2組相比，P<0.05

2.4干擾EpCAM表達(dá)對A549細(xì)胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2和表4。陰性對照組Ki-67和MMP-9蛋白的表達(dá)水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而EpCAM干擾組兩種蛋白的表達(dá)水平均降低。

圖2 各組A549細(xì)胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果

組別Ki-67MMP-9對照組0.78±0.050.59±0.03陰性對照組0.82±0.040.62±0.05EpCAM干擾組0.34±0.02*0.38±0.02*F141.86740.500P<0.001<0.001

*：與其他2組相比，P<0.05

3 討論

EpCAM基因廣泛存在于人上皮組織中，其蛋白是由腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)1基因編碼的相對分子質(zhì)量為40 000的單次跨膜蛋白，它由單次跨膜區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成，其中胞內(nèi)部分氨基酸可將信號傳遞到胞核，發(fā)揮調(diào)控下游基因的作用，進(jìn)而參與細(xì)胞間黏附、增殖、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。大量研究[8-10]指出，EpCAM在上皮性卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度等關(guān)系密切。在結(jié)腸癌中，利用siRNA沉默EpCAM基因，可明顯降低細(xì)胞或干細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時增強(qiáng)其對伊立替康、卡培他濱藥物的敏感性[11-12]。同時，在體內(nèi)上皮癌小鼠模型和體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中下調(diào)EpCAM的表達(dá)，能夠減弱細(xì)胞增殖[13]。有研究[7]指出，高表達(dá)EpCAM與肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，但其在NSCLC中的作用尚不清楚。本研究采用qRT-PCR和Western blot觀察EpCAM在H226、A549和PC-9細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，3種NSCLC細(xì)胞中EpCAM蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高，且腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于鱗癌細(xì)胞。提示，EpCAM在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。成功干擾A549細(xì)胞中EpCAM的表達(dá)后，采用CCK-8和平板克隆實驗進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖、克隆形成能力均明顯減弱；同時，采用Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的侵襲能力受到抑制?？梢姡蓴_EpCAM的表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲，這與Zhou等[8]的研究結(jié)果相吻合。

腫瘤細(xì)胞的無限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，可作為檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力的可靠指標(biāo)；腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而在降解細(xì)胞外基質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用的唯一酶類是MMP；MMP-9可通過降解Ⅳ型膠原破壞腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的組織學(xué)屏障，從而引發(fā)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ki-67和MMP-9表達(dá)與NSCLC患者病理類型、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有著密切關(guān)系[14-15]。在胃癌細(xì)胞中，EpCAM與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，EpCAM表達(dá)水平越高，胃癌細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)[16]；乳腺癌細(xì)胞中，敲除EpCAM基因可通過抑制Ras/Raf/ERK信號通路和MMP-9表達(dá)抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。為了探討干擾EpCAM表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制，本研究采用Western blot檢測抑制EpCAM表達(dá)后A549細(xì)胞中Ki-67和MMP-9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩種蛋白的表達(dá)水平較對照組均明顯降低。提示，干擾EpCAM的表達(dá)可能通過降低Ki-67和MMP-9的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)EpCAM在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，且腺癌中的表達(dá)水平高于鱗癌，提示EpCAM在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。干擾EpCAM的表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲，其分子機(jī)制可能與抑制Ki-67和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果為NSCLC的診斷和治療提供了新的線索和依據(jù)。