田文葭，李 琰，倪海祥

1)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 杭州 310006 2)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科 杭州 310009

椎間盤(pán)突出與糖尿病均是困擾現(xiàn)代人群的常見(jiàn)疾病，以往認(rèn)為兩者是互相獨(dú)立的疾病，而近年來(lái)的多項(xiàng)研究[1-2]均表明，兩者之間存在密切聯(lián)系。椎間盤(pán)退變的主要病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白聚糖和Ⅱ型膠原)的降解增加以及合成減少。而糖尿病作為一種全身性的代謝疾病，除了會(huì)損害常見(jiàn)的靶器官如視網(wǎng)膜、腎臟、大血管、神經(jīng)，也會(huì)對(duì)眼肌、骨、腦、乳腺等器官組織造成損害[3-4]。腰椎及頸椎間盤(pán)突出癥患者患糖尿病的比例較其他疾病患者明顯升高[1-2]，糖尿病伴腰椎間盤(pán)突出癥患者髓核中的蛋白多糖含量較單純腰椎間盤(pán)突出癥患者顯著降低[5]。這些研究在一定程度上解釋了糖尿病患者更容易發(fā)生椎間盤(pán)突出的原因，但是都沒(méi)有分析具體機(jī)制。Zhang等[6]、Cheng等[7]的研究證實(shí)了高糖環(huán)境與髓核細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)，然而對(duì)髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝與糖尿病的關(guān)系仍缺乏研究。本文分析了高糖環(huán)境對(duì)大鼠髓核細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)降解酶(MMP-3、MMP-13和ADAMTs)表達(dá)、基質(zhì)成分Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖表達(dá)的影響，以期明確葡萄糖濃度與髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝之間的關(guān)系，旨在進(jìn)一步探討糖尿病與椎間盤(pán)退變之間的可能聯(lián)系及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1大鼠髓核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)4～6周齡SD大鼠30只，雌雄對(duì)半，購(gòu)自上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0021，飼養(yǎng)于全屏障清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房?jī)?nèi)。大鼠腹腔注射戊巴比妥(150 mg/kg)，處死，剪去背部毛發(fā)，絡(luò)合碘消毒后，沿棘突正中切口切開(kāi)至脊柱，剝離椎旁肌，鈍性分離脊柱，咬除肋骨，完整分離胸椎下段及腰椎。將分離的胸、腰椎移至無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用尖刀切開(kāi)纖維環(huán)，用顯微鑷挑出完整髓核組織，PBS清洗3遍，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，加入2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化液于37 ℃水浴中消化5 min，加入含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清。再次加入2 g/LⅡ型膠原酶于37 ℃水浴中消化100 min，加入含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化。用200目無(wú)菌不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾后，將濾液移至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清。使用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞以3×108個(gè)/L接種至直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器倒置顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)，PCR儀(美國(guó)THERMO公司)，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(日本TAKARA)，ELISA檢測(cè)試劑盒(上海邦奕公司)，免疫組化試劑盒及Ⅱ型膠原蛋白一抗(武漢博士德公司)，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4一抗(美國(guó)CST公司)，P38、磷酸化P38(p-P38)、GAPDH一抗(美國(guó)Abcam公司)。

1.3不同濃度葡萄糖作用后髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)情況大鼠髓核細(xì)胞貼壁后在光鏡下觀察。取2～3代細(xì)胞，重懸后以5×103個(gè)/孔的密度種于96孔板中，使用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，每24 h使用CCK-8試劑盒檢測(cè)1次細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)時(shí)，移除96孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8溶液10 μL，室溫下孵育2 h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4不同濃度葡萄糖作用后髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖mRNA的檢測(cè)將髓核細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度種于6孔板中，用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3遍。使用Trizol法提取總RNA，DEPC水溶解，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，冰上操作，每1 μg RNA加入4 μL反轉(zhuǎn)錄混合試劑，補(bǔ)DEPC水使總體積至20 μL，然后按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的條件行反轉(zhuǎn)錄。以制備的cDNA為模板,以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行Real-time PCR。使用BLAST設(shè)計(jì)引物(表1)。冰上操作配置20 μL PCR反應(yīng)體系：SYBR酶10 μL、上下游引物各0.4 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、DNA模板2.0 μL、DEPC水6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。使用2-ΔΔCT法計(jì)算目的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物列表

1.5不同濃度葡萄糖作用后髓核細(xì)胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、P38及p-P38蛋白的檢測(cè)將髓核細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度種于6孔板中，使用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，使用RIPA裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配置100 g/L SDS-PAGE凝膠，加入蛋白樣品及Marker，80 V恒壓電泳2 h，切下凝膠，冰浴下恒流(0.25 A)轉(zhuǎn)膜2 h。50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后加入按1∶1 000稀釋的MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、P38及p-P38一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入按1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h。以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Odyssey的紅外成像系統(tǒng)(LI-COR)檢測(cè)蛋白條帶并進(jìn)行定量分析。

1.6不同濃度葡萄糖作用后髓核細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅱ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX-Ⅱ)質(zhì)量濃度測(cè)定將髓核細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度種于6孔板中，用含不同濃度(5、15、25 mmol/L)葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液1 mL，4 000 r/min離心5 min后取上清,使用CTX-Ⅱ ELISA試劑盒檢測(cè)CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7不同濃度葡萄糖作用后髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白的檢測(cè)制備髓核細(xì)胞爬片，在含不同濃度(5、15、25 mmol/L )葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d，取出細(xì)胞爬片，用PBS清洗，以多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗，用Triton X-100處理10 min，用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2處理5 min。PBS清洗，加入按1∶200稀釋的Ⅱ型膠原蛋白一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h。DAB顯色，PBS沖洗，脫水，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus 6.0 分析染色結(jié)果，以積分光密度(IOD)值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況大鼠髓核細(xì)胞貼壁后在光鏡下呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞折光性好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞周圍可見(jiàn)基質(zhì)樣物質(zhì)沉積。第1～3代髓核細(xì)胞活力較佳，生長(zhǎng)快，約5 d可以達(dá)到90%融合。從第4代開(kāi)始細(xì)胞逐漸出現(xiàn)退變現(xiàn)象，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，體積縮小，基質(zhì)樣物質(zhì)減少，細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，細(xì)胞間隙減小，逐漸向類成纖維細(xì)胞發(fā)展(圖1)。本實(shí)驗(yàn)選取第2～3代細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖1)顯示： 25 mmol/L組的髓核細(xì)胞生長(zhǎng)較5、15 mmol/L組減緩(P<0.001)。

*：與5、15 mmol/L組比較，P<0.001

2.2 3組大鼠髓核細(xì)胞蛋白聚糖mRNA、Ⅱ型膠原蛋白mRNA和蛋白及CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度的比較見(jiàn)圖 2、表2。培養(yǎng)24 h后25 mmol/L組細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖mRNA表達(dá)水平較5、15 mmol/L組降低(P<0.05)。培養(yǎng)48 h后25 mmol/L組細(xì)胞培養(yǎng)液中CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度較5、15 mmol/L組增加(P<0.05)。培養(yǎng)5 d后，Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，3組均陽(yáng)性染色，25 mmol/L組細(xì)胞的IOD值較其他兩組降低(P<0.05)。

A:5 mmol/L組；B:15 mmol/L組；C:25 mmol/L組

組別nⅡ型膠原蛋白mRNA蛋白聚糖mRNAⅡ型膠原蛋白ρ(CTX-Ⅱ)/(μg/L)5 mmol/L組30.98±0.021.01±0.0611.58±0.920.82±0.1315 mmol/L組31.04±0.090.96±0.0811.28±0.930.71±0.1525 mmol/L組30.81±0.06*#0.82±0.04*4.23±0.13*#1.16±0.06*#F10.5877.52690.107 11.519P0.0110.023<0.001 0.009

*：與5 mmol/L比較，P<0.05；#：與15 mmol/L比較，P<0.05

2.3 3組髓核細(xì)胞中MMP-3、MMP-13和ADAMTS-4表達(dá)水平的比較見(jiàn)圖3和表3。25 mmol/L組細(xì)胞MMP-3、MMP-13表達(dá)水平較5、15 mmol/L組升高，而3組ADAMTS-4表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 3組細(xì)胞中基質(zhì)降解酶的表達(dá)

組別nMMP-3MMP-13ADAMTS-45 mmol/L組30.28±0.050.38±0.040.55±0.0515 mmol/L組30.30±0.020.40±0.020.53±0.0425 mmol/L組30.47±0.05*#0.50±0.01*#0.49±0.04F18.16717.7141.474P0.0030.0030.302

*：與5 mmol/L比較，P<0.05；#：與15 mmol/L比較，P<0.05

2.4 3組髓核細(xì)胞中P38磷酸化水平的比較Western blot結(jié)果見(jiàn)圖4。培養(yǎng)24 h后，5、15、25 mmol/L組p-P38/P38分別為(0.10±0.01)、(0.17±0.01)和(0.63±0.09),3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.892,P<0.001)；25 mmol/L組細(xì)胞P38磷酸化水平較其他2組升高(P<0.001)。

圖4 3組細(xì)胞P38、p-P38的表達(dá)

3 討論

椎間盤(pán)是人體內(nèi)最大的無(wú)血供組織，主要通過(guò)兩種方式獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其一為終板途徑(主要通過(guò)軟骨終板擴(kuò)散營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))，其二為纖維環(huán)途徑(主要通過(guò)纖維環(huán)表面的血管來(lái)傳送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))，因此椎間盤(pán)內(nèi)的髓核細(xì)胞長(zhǎng)期在低糖、低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)。葡萄糖是椎間盤(pán)的主要供能物質(zhì)，已有研究[8]表明，椎間盤(pán)內(nèi)的葡萄糖主要通過(guò)濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)行運(yùn)輸，這也就意味著血糖升高勢(shì)必造成椎間盤(pán)內(nèi)葡萄糖濃度隨之升高。高濃度的葡萄糖可能導(dǎo)致椎間盤(pán)內(nèi)乳酸堆積，進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制髓核細(xì)胞的增殖以及促使髓核細(xì)胞凋亡[7]。另一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)[9]也證實(shí)，高濃度葡萄糖對(duì)髓核細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。本研究中體外分離培養(yǎng)的大鼠髓核細(xì)胞在貼壁后增殖迅速，在使用25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后，髓核細(xì)胞的增殖明顯受抑，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸加強(qiáng)；而15、5 mmol/L濃度的葡萄糖對(duì)大鼠髓核細(xì)胞增殖的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示髓核細(xì)胞對(duì)葡萄糖濃度存在耐受閾值，超過(guò)這個(gè)閾值后其增殖會(huì)受到抑制，而在此閾值之下增殖并未受到明顯影響。

在正常椎間盤(pán)中，細(xì)胞外基質(zhì)處于不斷降解和合成的動(dòng)態(tài)平衡中。基質(zhì)降解酶與其抑制劑的表達(dá)失衡是椎間盤(pán)退變的重要原因之一[10-11]。在椎間盤(pán)中，MMP和ADAMTS是主要的基質(zhì)降解酶。研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，血糖升高會(huì)導(dǎo)致血清MMP水平增高，從而影響MMP與其抑制劑TIMP的平衡，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。Won等[15]發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠椎間盤(pán)組織內(nèi)MMP的表達(dá)較非糖尿病大鼠顯著增強(qiáng)，從而間接證實(shí)糖尿病與椎間盤(pán)退變存在聯(lián)系。我們的研究結(jié)果也顯示：25 mmol/L組的髓核細(xì)胞MMP-3和MMP-13表達(dá)上升，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中CTX-Ⅱ質(zhì)量濃度增加；而ADAMTS-4的表達(dá)并無(wú)明顯變化。這提示我們，高糖環(huán)境對(duì)基質(zhì)降解酶的調(diào)控主要針對(duì)MMP。不僅如此，高糖環(huán)境對(duì)髓核細(xì)胞的基質(zhì)合成也可能存在一定影響。Robinson等[5]發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的腰椎間盤(pán)突出癥患者髓核中蛋白聚糖的含量較非糖尿病患者減少。作為髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，蛋白聚糖的減少與基質(zhì)含量減少直接相關(guān)。我們的研究也證實(shí)高糖環(huán)境能夠顯著減少大鼠髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表達(dá)。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為高糖環(huán)境可以通過(guò)抑制基質(zhì)合成及增加基質(zhì)降解兩條途徑來(lái)減少髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)含量。

P38是MAPK信號(hào)通路的成員之一，已有研究[16-17]證實(shí)其與椎間盤(pán)基質(zhì)代謝關(guān)系密切；P38抑制劑能夠顯著改善由炎癥因子引起的基質(zhì)分解增加與合成下降。Cheng等[7]證實(shí)高糖環(huán)境能夠誘發(fā)大鼠髓核細(xì)胞P38磷酸化，進(jìn)而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡增加。我們也發(fā)現(xiàn)25 mmol/L組大鼠髓核細(xì)胞中P38磷酸化水平提高。這一結(jié)果與髓核細(xì)胞的基質(zhì)變化相符，提示P38在髓核細(xì)胞對(duì)高糖環(huán)境的反應(yīng)中起了重要作用。

綜上所述，高濃度葡萄糖可抑制大鼠髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過(guò)抑制基質(zhì)合成及增加基質(zhì)降解兩條途徑來(lái)減少髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)含量，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)的退變；這一變化可能與P38磷酸化程度有密切關(guān)系。未來(lái)可以針對(duì)這一方向展開(kāi)進(jìn)一步研究，從而明確高糖環(huán)境對(duì)髓核細(xì)胞基質(zhì)代謝調(diào)控的具體作用機(jī)制。