于富洋，楊勝昌，郭亞凈，李文雅，吉恩生

河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室 石家莊 050091

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea，OSA)以睡眠期間的上呼吸道塌陷、睡眠不足、日間嗜睡為特征，可增加心律失常、心肌缺血、充血性心力衰竭及系統(tǒng)性高血壓等一系列心血管系統(tǒng)疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。OSA患者睡眠期間反復(fù)缺氧再復(fù)氧，即慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)，被認(rèn)為是誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病的主要因素[3]。CIH可以通過刺激頸動(dòng)脈體化學(xué)感受器和抑制頸動(dòng)脈竇壓力感受反射或直接提高中樞交感神經(jīng)活性，引起腎交感神經(jīng)傳出增強(qiáng)，導(dǎo)致血壓升高[4]。CIH暴露可導(dǎo)致大鼠心室壁顯著增厚，心肌細(xì)胞排列紊亂，誘導(dǎo)心肌損傷[5]。目前對(duì)于CIH誘導(dǎo)的高血壓以及心臟損傷尚無較好的治療措施。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為OSA屬于“鼾癥”，歷代醫(yī)家雖未對(duì)其形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，但多認(rèn)為與肺脾腎的功能異常有直接關(guān)系，痰、瘀、虛為主要成因[6-7]。消痰化瘀利竅方是針對(duì)患者脾虛失運(yùn)、肺氣失宣、痰阻血瘀，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，能夠有效改善患者癥狀，緩解并發(fā)癥的發(fā)生。本研究觀測了消痰化瘀利竅方對(duì)CIH模型大鼠交感神經(jīng)放電情況和血壓的影響，探討其對(duì)心肌肥大和心肌纖維化的保護(hù)作用，為OSA的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)防治提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1消痰化瘀利竅方的制備消痰化瘀利竅方由丹參30 g、法半夏12 g、陳皮10 g、茯苓15 g、生黃芪15 g、炒白術(shù)12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、白芥子10 g、桔梗12 g、枳殼15 g、川芎12 g、赤芍15 g、地龍12 g組成，以水煮醇沉法制備,含生藥2.4 g/mL。上述中藥材均購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組雄性SD大鼠48只，體重(240±20) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)平均分成4組：常氧組、CIH組、常氧+中藥干預(yù)組和CIH+中藥干預(yù)組。大鼠自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。在白天進(jìn)行造模。將CIH及CIH+中藥干預(yù)組大鼠置于CIH艙(BioSpherix公司Oxycycler Model 84)中，前1.5 min向艙內(nèi)充入100%氮?dú)馐寡鯕怏w積分?jǐn)?shù)降至9%，后1.5 min充入純氧使氧氣體積分?jǐn)?shù)升至21%，每一循環(huán)3 min。同時(shí)，將常氧組和常氧+中藥干預(yù)組大鼠置于CIH艙內(nèi)，但向艙內(nèi)充入空氣。每天8：00至16：00上艙，共21 d。每天上艙前，CIH+中藥干預(yù)組和常氧+中藥干預(yù)組給予消痰化瘀利竅方灌胃(生藥量24 g/kg,以中藥藥理研究方法學(xué)的大鼠與人藥物劑量折算方法折算)，CIH與常氧組灌服同等體積生理鹽水。

1.3尾動(dòng)脈收縮壓測定以造模前5 d測得血壓的均數(shù)作為大鼠基礎(chǔ)血壓。造模第7、14和21天測量血壓，測量時(shí)間固定于16：00至18：00。用BP-2000血壓分析系統(tǒng)測定大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。將大鼠固定于籠內(nèi)加熱帶上，38 ℃預(yù)熱10 min后開始15次測量，取后10次測量值的均數(shù)作為血壓值。

1.4血清去甲腎上腺素(NE)水平測定大鼠于造模前1 d及造模第7、14、21天乙醚麻醉后內(nèi)眥取血，室溫放置30 min后4 ℃、1 500×g離心15 min，分離血清，按照ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)實(shí)驗(yàn)流程測定NE水平。

1.5腎交感神經(jīng)放電記錄造模21 d后，用烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，右側(cè)臥位，分層暴露腎臟。于冷光解剖顯微鏡下找到左側(cè)腎神經(jīng)，用玻璃分針將其輕輕掛于雙極鉑金絲電極上，用液體石蠟覆蓋。通過PowerLab進(jìn)行圖像采集、分析和處理，采樣率4 kHz，記錄腎交感神經(jīng)活性(renal sympathetic activity, RSNA)。

1.6組織病理學(xué)觀察造模21 d后，大鼠稱體重，用烏拉坦腹腔注射麻醉，取心臟并去除多余組織，分離左心室并稱重，計(jì)算左心室質(zhì)量/體重的比值；將組織標(biāo)本用多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色與Masson染色，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較4組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化，4組大鼠RSNA、血清NE水平及左心室質(zhì)量/體重的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的變化4組大鼠各時(shí)間段尾動(dòng)脈收縮壓測定結(jié)果見表1。常氧組和常氧+中藥干預(yù)組尾動(dòng)脈收縮壓無明顯變化；CIH組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓逐漸升高，造模第14天、21天明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.05)；CIH+中藥干預(yù)組大鼠第21天尾動(dòng)脈收縮壓高于基礎(chǔ)值，但升高幅度小于CIH組。

表1 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的尾動(dòng)脈收縮壓 mmHg

F時(shí)間=17.507，F(xiàn)組別=25.321，F(xiàn)交互=99.726，P<0.001；*：與基礎(chǔ)值比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa

2.2 4組大鼠RSNA和血清NE水平的比較4組大鼠RSNA及血清NE水平測定結(jié)果見表2。可知，CIH暴露可增加RNSA、血清NE水平，但中藥干預(yù)可顯著降低CIH暴露大鼠的RSNA及血清NE水平。

2.3 4大鼠左心室組織病理學(xué)表現(xiàn)HE和Masson染色結(jié)果見圖1，4組大鼠左心室質(zhì)量/體重的比值見表2。常氧組和常氧+中藥干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊；CIH組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，左心室心肌細(xì)胞纖維化增多；CIH+中藥干預(yù)組心肌結(jié)構(gòu)改變和纖維化較CIH組明顯減輕。CIH引起左心室質(zhì)量/體重比值增加，中藥干預(yù)可拮抗CIH引起的左心室質(zhì)量/體重比值增加。

A1，B1:常氧組; A2，B2：CIH組;A3，B3：CIH+中藥干預(yù)組;A4，B4:常氧+中藥干預(yù)組

組別nRSNA/(mV·s)ρ(NE)/(mg/L)(左心室質(zhì)量/體重)/(×10-5)常氧組1221.96±2.551 511.11±155.99221.6±15.7CIH組1234.38±3.802 325.33±225.24265.4±16.0CIH+中藥干預(yù)組1226.88±5.231 789.17±280.73232.2±11.7常氧+中藥干預(yù)組1223.16±3.011 652.39±213.28229.4±9.7FCIH(P)22.821(<0.001)37.183(<0.001)14.771(0.005)F中藥(P)3.788(0.088)3.932(0.083)4.388(0.069)F交互(P)7.043(0.029)11.565(0.009)11.434(0.009)

3 討論

OSA患者“睡眠時(shí)打鼾、白天嗜睡、乏力而睡不解乏”等臨床表現(xiàn)與中醫(yī)學(xué)中“鼻鼾”“酣眠”“但欲寐”相似，屬于“鼾癥”范疇。“鼾癥”雖在較早就被醫(yī)家提出，但其仍未作為一個(gè)獨(dú)立的病癥被系統(tǒng)地描述，因此目前對(duì)其病因病機(jī)、臨床辨證分型均未形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，缺乏相應(yīng)的中醫(yī)藥研究。流行病學(xué)調(diào)查[8]結(jié)果顯示，約50%的OSA患者患有高血壓，而30%～40%的高血壓患者也表現(xiàn)出臨床相關(guān)的OSA癥狀。研究[3]證實(shí)，OSA患者出現(xiàn)的間歇性低氧是誘導(dǎo)高血壓和心血管損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。眾多實(shí)驗(yàn)研究[9-11]表明，大鼠或小鼠在CIH暴露3至4 d后即可表現(xiàn)出動(dòng)脈血壓升高。本研究采用SD大鼠建立CIH模型并觀察尾動(dòng)脈收縮壓的變化，結(jié)果顯示CIH大鼠尾動(dòng)脈收縮壓隨暴露時(shí)間增長而逐漸升高。

我們根據(jù)多年臨床觀察并綜合借鑒各家學(xué)說認(rèn)為，脾失健運(yùn)是本病的主要成因，痰瘀互阻、氣機(jī)不利是病機(jī)的中心環(huán)節(jié)，本虛標(biāo)實(shí)是病機(jī)的主要特點(diǎn)。多年的臨床實(shí)踐表明，消痰化瘀利竅方能明顯改善OSA患者多寐、善忘、眩暈、頭痛等臨床癥狀，有效緩解高血壓等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。方中生黃芪、炒白術(shù)益氣健脾、燥濕利水，以治生痰之源；法半夏、陳皮、茯苓燥濕化痰；石菖蒲、郁金祛痰開竅；白芥子、射干利氣機(jī)，消痰涎；桔梗、枳殼宣肺利氣，通利咽喉；川芎、赤芍、丹參活血化瘀；地龍熄風(fēng)通絡(luò)，舒攣緩痙。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示消痰化瘀利竅方能夠顯著拮抗CIH模型大鼠的血壓升高，為OSA并發(fā)高血壓的中醫(yī)藥防治提供了初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

交感神經(jīng)過度激活是CIH誘導(dǎo)血壓升高的重要機(jī)制之一[4]。研究[12-14]發(fā)現(xiàn)短期的呼吸暫停就能夠引起交感神經(jīng)活性明顯增強(qiáng)。CIH期間的缺氧可以刺激頸動(dòng)脈體,提高頸動(dòng)脈體化學(xué)感受器敏感性，上調(diào)舌咽神經(jīng)至孤束核的興奮性傳入，進(jìn)而激活中樞交感神經(jīng)[4]。相繼激活的孤束核與延髓頭端腹外側(cè)區(qū)向腎交感神經(jīng)的投射增多，在引起大鼠腎交感神經(jīng)兒茶酚胺分泌增多的同時(shí)，刺激室周器官進(jìn)一步增加中樞交感神經(jīng)的傳出[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消痰化瘀利竅方能夠降低CIH引起的大鼠RSNA增強(qiáng)，同時(shí)降低血清NE水平；提示該方可通過抑制交感神經(jīng)活性進(jìn)而改善CIH誘導(dǎo)的血壓升高。

血壓升高可引起心臟結(jié)構(gòu)及功能損傷，如心肌細(xì)胞肥大、纖維化等一系列變化[3,16]。Hayashi等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠暴露于CIH 10 d即可表現(xiàn)出心肌細(xì)胞橫截面積增加和明顯的心肌間質(zhì)纖維化。CIH還可引起大鼠左心室質(zhì)量增加，加重的氧化應(yīng)激水平、炎癥反應(yīng)與之相關(guān)[3,16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，CIH暴露21 d可引起大鼠左心室肥大、心肌纖維化及心肌細(xì)胞排列異常；消痰化瘀利竅方干預(yù)可改善心肌肥大和纖維化；提示該方具有延緩OSA導(dǎo)致高血壓和心臟損傷的功效。

綜上所述，本研究證實(shí)消痰化瘀利竅方可以降低RSNA進(jìn)而降低CIH誘導(dǎo)的血壓升高，改善心肌肥大和心肌纖維化，這為OSA的中醫(yī)藥防治提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。