顧 清，張 莉，張新星，代小松，陳和平

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(四川省人民醫(yī)院)老年消化科 成都 610072

肝癌是一種常見的癌癥，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。研究[1]表明，每年檢測到超過60萬例原發(fā)性肝癌新病例。盡管肝癌患者的5 a生存率有所提高，但肝癌患者的預(yù)后較差[2]。由于對目前可用的化療藥物的耐藥性和對放射療法的耐受性，肝癌很容易向其他組織如肺、淋巴結(jié)、骨骼和腎上腺等發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。因此，需要開發(fā)新的和有效的肝癌治療策略。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已證實(shí)[4]肝癌是一系列多基因引發(fā)的疾病。從基因?qū)用嫔咸骄科浒l(fā)病機(jī)制可為肝癌治療提供有效的作用靶點(diǎn)。ERBB2基因又稱HER2基因，具有廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡的功能[5]。目前研究[6-8]顯示，ERBB2基因的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ERBB2基因在乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、胰腺癌[8]等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)。靶向抑制ERBB2表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和侵襲[9]。多種因素能夠通過下調(diào)ERBB2表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞增殖和生長[10-11]。多項(xiàng)研究[12-13]顯示，ERBB2能夠通過調(diào)控PI3K/AKT通路調(diào)控癌細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)過程。PI3K/AKT信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，抑制該信號通路能夠抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。近期研究[15]發(fā)現(xiàn)，ERBB2在肝癌組織中呈高表達(dá)，提示ERBB2可能參與肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。但目前國內(nèi)外關(guān)于ERBB2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究仍較少，因此本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中ERBB2的表達(dá)，進(jìn)一步探究其對肝癌細(xì)胞生長的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞系HepG2(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；由上海吉瑪制藥有限公司構(gòu)建ERBB2 siRNA(序列為5’-GATCCGAGATCACAGGTTACCTATTTCAAGCGAATAGGTAACCTGTGATCTCTTTTTT GGAAA-3’)；PI/RNase染色試劑盒(美國BD公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；Trizol試劑、SYBR Primix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Thermo Fisher公司)；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體、AKT抗體和p-AKT抗體(美國CST公司)；PVDF膜、HRP標(biāo)記的二抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；ECL顯色試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)約90%時，采用2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，每1～2 d傳代1次，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組轉(zhuǎn)染前1 d將肝癌HepG2細(xì)胞以胰蛋白酶消化，種植在6孔板中，種植密度為4×105個/孔，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度約為60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，ERBB2 siRNA和siRNA對照的轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染ERBB2 siRNA的HepG2細(xì)胞記為ERBB2-siRNA組，將轉(zhuǎn)染siRNA 對照的HepG2細(xì)胞記為Con-siRNA組，將不經(jīng)任何處理的HepG2細(xì)胞記為空白對照組。轉(zhuǎn)染后置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.4qRT-PCR檢測細(xì)胞中ERBB2mRNA表達(dá)水平轉(zhuǎn)染24 h后分別收集各組HepG2細(xì)胞，以Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，測定RNA濃度和純度后，選取合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄過程加樣及程序設(shè)置均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用SYBR Primix Ex Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ERBB2引物序列：上游引物5’-TGGAGGACAAGTAATGATCTCCTGG-3’，下游引物5’-AAGAGAGACCAGCAGCCCAGACCTG-3’；內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物5’-CATCTCTT GCTCGAAGTC-3’，下游引物5’-AAGGATTCCTAT GTGCCC-3’。實(shí)驗(yàn)采用20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后統(tǒng)計Ct值，采用2-ΔΔCt法計算ERBB2 mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Westernblot測定細(xì)胞中ERBB2、PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平分別收集轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞，加入適量RIPA蛋白裂解液置冰上提取細(xì)胞中總蛋白。采用BCA法測定提取蛋白的濃度，加入上樣緩沖液與蛋白混合，沸水浴15 min使蛋白變性，取等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后以半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉液封閉2 h。分別用一抗4 ℃過夜雜交：ERBB2抗體1∶1 000稀釋，PCNA抗體1∶500稀釋，AKT抗體1∶800稀釋，p-AKT抗體1∶800稀釋。TBST洗膜3次，二抗(1∶5 000稀釋)室溫雜交1 h。TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。以GAPDH標(biāo)定，采用Image J圖像分析軟件計算各組細(xì)胞中ERBB2、PCNA、AKT和p-AKT蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，以每孔3×103個細(xì)胞接種于96孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長融合度為50%～60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時設(shè)置Con-siRNA組和空白對照組，轉(zhuǎn)染6 h后更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育，分別在24、48、72、96 h時在每孔細(xì)胞中添加10 μL CCK-8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處細(xì)胞光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)測得的OD值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)用軟瓊脂將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行鋪板，置培養(yǎng)皿中待用。分別收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化并計數(shù)，以液態(tài)軟瓊脂重懸細(xì)胞，種植于6孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2～3周，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，用純甲醇固定15 min，加適量的Giemsa染色液染色20 min，洗去染色液后干燥，在低倍顯微鏡下觀察并計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各組HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后收集1×105～5×105個細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞，分別在每組細(xì)胞中加入0.5 mL PI/RNase 染色液，輕輕混勻，在室溫下避光反應(yīng)10 min，隨后上流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？瞻讓φ战M、Con-siRNA組、ERBB2-siRNA組間ERBB2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量，克隆形成數(shù)，細(xì)胞周期及PCNA、AKT和p-AKT蛋白相對表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細(xì)胞中ERBB2表達(dá)的影響結(jié)果見圖1和表1?？芍?，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組HepG2細(xì)胞中ERBB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)；與空白對照組比較，Con-siRNA組HepG2細(xì)胞中ERBB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1：空白對照組；2：Con-siRNA組；3：ERBB2-siRNA組

組別ERBB2 mRNAERBB2蛋白空白對照組1.00±0.100.22±0.02Con-siRNA組0.96±0.090.20±0.02ERBB2-siRNA組0.28±0.03*0.03±0.01*F77.558 109.000 P<0.001 <0.001

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

2.2轉(zhuǎn)染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響結(jié)果見圖2?？瞻讓φ战M、Con-siRNA組、ERBB2-siRNA組HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為(42.66±5.04)、(43.10±4.86)、(15.14±2.16)，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.008，P<0.001)。與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組細(xì)胞增殖受到抑制，且克隆形成數(shù)目減少(P<0.05)。

圖2 各組HepG2細(xì)胞生長曲線

2.3轉(zhuǎn)染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表2?？芍?，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組G0/G1期細(xì)胞增多， S期細(xì)胞減少。

表2 各組HepG2細(xì)胞周期的比較(n=3) %

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

2.4轉(zhuǎn)染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細(xì)胞中PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3和表3?？芍?，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組HepG2細(xì)胞中PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平下調(diào)。

1：空白對照組；2：Con-siRNA組；3：ERBB2-siRNA組

組別PCNAAKTp-AKT空白對照組0.37±0.041.22±0.130.41±0.05Con-siRNA組0.41±0.041.26±0.110.40±0.04ERBB2-siRNA組0.06±0.01*0.25±0.02*0.05±0.01*F100.091100.13390.071P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

3 討論

肝癌是臨床上最常見的實(shí)體瘤，也是一種發(fā)病率和病死率增長較快的惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，中國每年約有11萬人死于肝癌。肝癌早期主要通過外科手術(shù)治療，然而，肝癌患者中只有不到50%是在早期診斷出來的。晚期肝癌對當(dāng)前的化學(xué)和放射療法具有很強(qiáng)的抵抗性，存活率較低，為40%～50%，預(yù)后極差，5 a復(fù)發(fā)率大于60%。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因靶向治療在一定范圍內(nèi)改善了肝癌患者的存活率。因此探討肝癌發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)對肝癌的治療具有非常重要的意義。目前研究[16]證實(shí)，ERBB2基因在肝硬化患者血液和組織中呈高表達(dá)，該基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，提示ERBB2基因可能成為肝癌治療的潛在靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)在肝癌HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ERBB2 siRNA，經(jīng)qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ERBB2 siRNA能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞ERBB2 mRNA和蛋白表達(dá)。分別采用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和克隆形成能力，結(jié)果顯示，抑制ERBB2基因后細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力均明顯受到抑制。

PCNA在細(xì)胞周期G1晚期大量表達(dá)，在S期達(dá)到最高峰。PCNA是一種保守的核蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞復(fù)制和DNA修復(fù)過程。由于PCNA僅存在于處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞核內(nèi)，因此將其作為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。目前研究[17]表明，PCNA可作為反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中抑制ERBB2基因的表達(dá)后，采用Western blot法檢測PCNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中PCNA蛋白水平顯著下調(diào)，提示肝癌細(xì)胞增殖受到抑制。此外本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)ERBB2基因表達(dá)下調(diào)后G0/G1期細(xì)胞比例增多，S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，這與先前的研究[18-20]結(jié)果一致。

PI3K/AKT信號通路廣泛在人類腫瘤中異常表達(dá)，AKT被PI3K磷酸化而激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡。研究[21-22]顯示，PI3K/AKT信號通路在肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。抑制PI3K/AKT信號通路可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻礙腫瘤的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)在肝癌細(xì)胞中抑制ERBB2基因，經(jīng)蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白磷酸化水平顯著降低，說明下調(diào)ERBB2基因的表達(dá)能夠抑制PI3K/AKT信號通路的活化，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞生長，這與Li等[23]研究結(jié)果相似。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，下調(diào)ERBB2基因的表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活抑制肝癌細(xì)胞的生長。

總之，本研究結(jié)果表明，抑制ERBB2基因可以抑制肝癌細(xì)胞生長并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。