陳建安，陳思玉，劉麗文，朱威威，陳曉龍，余 炎，何玉婷，孫冉冉，任志剛，李 娟，崔光瑩，余祖江

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州450052

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是我國(guó)最常見和致死率較高的惡性腫瘤之一[1]。其惡性程度高，進(jìn)展快，除了早期外科手術(shù)切除外，放、化療多不能取得滿意的療效，且預(yù)后極差[2]。因此，探索HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的預(yù)后判斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)提高HCC治愈率具有重要的臨床意義。

高遷移率族蛋白(high mobility group box,HMGB)是真核細(xì)胞核內(nèi)一類含量豐富的核蛋白，功能多樣。在細(xì)胞中，作為核DNA結(jié)合蛋白，HMGB1和HMGB2高度保守[3-4]。作為細(xì)胞外成分，HMGB家族與敗血癥、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病關(guān)系密切[5]。HMGB1在各種人類癌癥中過表達(dá)，包括前列腺癌、人腦膠質(zhì)瘤[6]、前列腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]和乳腺癌[9]等。更重要的是，HMGB優(yōu)先結(jié)合順鉑(Ⅱ)二酰氯(順鉑)修飾的DNA或錯(cuò)誤摻入的核苷類似物，并因此抑制核苷酸切除修復(fù)，這可能對(duì)于癌癥治療很有價(jià)值[10]。目前對(duì)HMGB2的研究相對(duì)較少，主要集中在胃癌[11]、乳腺癌[12]等。本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)和GEO公共數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證HMGB2在HCC組織中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，同時(shí)分析了HMGB2對(duì)HCC細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡、周期的影響，探討其對(duì)HCC發(fā)展預(yù)測(cè)和靶向治療的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1TCGA和GEO公共數(shù)據(jù)庫有關(guān)HCCHMGB2表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析

1.1.1 數(shù)據(jù)下載及過濾 下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的HCC相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)HMGB2 mRNA表達(dá)由低到高排序，低于中位數(shù)節(jié)點(diǎn)的樣本為低表達(dá)組，高于中位數(shù)節(jié)點(diǎn)的樣本為高表達(dá)組。下載GEO數(shù)據(jù)庫中7個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE76297，GSE10143，GSE14520，GSE25097，GSE36376，GSE102083，GSE57957)中有關(guān)HCC HMGB2 mRNA表達(dá)譜文件。數(shù)據(jù)過濾方法參見文獻(xiàn)[13]。

1.1.2富集分析(genesetenrichmentanalysis，GSEA) 采用 GSEA 2.2.1分別對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中HMGB2 mRNA低表達(dá)組和高表達(dá)組進(jìn)行分析。利用 GSEA網(wǎng)站 MsigDB數(shù)據(jù)庫獲得 c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)集，然后按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析，隨機(jī)組合次數(shù)為 1 000。

1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器人正常肝細(xì)胞LO2、HCC細(xì)胞株SMMC7721和Hep3B購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國(guó)HyClone公司，HMGB2抗體和β-actin抗體購于武漢三鷹公司，HMGB2 siRNA(序列為5’-CUGAACAUCGCCCAAAGAU-3’)及陰性對(duì)照(NC)siRNA(序列為5’-UUCUCCGAACGU GUCACGUTT-3’)由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8試劑購于日本同仁公司，Matrigel膠和Transwell小室購于BD公司，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基公司。

1.3HMGB2siRNA轉(zhuǎn)染后HCC細(xì)胞生物學(xué)活性的檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，取狀態(tài)好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721和Hep3B細(xì)胞接種于6孔板，用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染HMGB2 siRNA、NC siRNA并設(shè)置空白對(duì)照,48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HMGB2蛋白的檢測(cè) 用RIPA裂解蛋白提取試劑(中國(guó)碧云天公司)和蛋白酶抑制劑(美國(guó)羅氏公司)收集細(xì)胞和細(xì)胞裂解物，取等量蛋白行100 g/L SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，USA)上，用含50 g/L脫脂乳和TBS緩沖液封閉1 h，加HMGB2抗體(按1∶1 000稀釋)、內(nèi)參β-actin抗體(按1∶5 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌3次，經(jīng)二抗孵育1 h和洗滌后，將膜暴露，用Labwork對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞以每孔5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24、72和120 h后分別進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 Transwell 體外遷移實(shí)驗(yàn) 選用孔徑為8 μm 的24孔 Borden 小室，上室加入1×105個(gè)細(xì)胞，總體積200 μL，下室加入300 μL含血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。48 h后取出小室，甲醇固定并用結(jié)晶紫染色孵育10 min以去除上層小室側(cè)的未遷移細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1×binding buffer 重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，離心棄上清，用適量1×binding buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料混勻后避光孵育15 min，上流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2遍，2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心棄上清，加入冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇4 ℃孵育1 h。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS 2 mL重懸細(xì)胞。再加入300 μL PI，4 ℃下避光孵育30 min，上流式儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 17.0和GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；HCC組織和癌旁正常組織中,以及不同臨床病理特征的HCC組織中HMGB2 mRNA表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；3組細(xì)胞中HMGB2蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.1.1 HCC組織中HMGB2 mRNA的表達(dá)特點(diǎn) TCGA數(shù)據(jù)集及GEO數(shù)據(jù)集分析結(jié)果(表1)顯示，患者年齡中位數(shù)為59歲；HCC組織中HMGB2 mRNA表達(dá)水平較癌旁正常組織升高。TCGA數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，HCC組織中HMGB2 mRNA表達(dá)水平與種族、甲胎蛋白表達(dá)水平、TNM分期及分化程度有關(guān)，與種族、性別、 年齡無關(guān)(表2)；針對(duì)總體生存(overall survival，OS)、無進(jìn)展生存(progression-free survival，PFS)的生存分析結(jié)果顯示，HMGB2 mRNA高表達(dá)組預(yù)后差于低表達(dá)組(圖1，χ2分別為8.162、4.819，P分別為0.028、0.004)。OS時(shí)間指從隨機(jī)化開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間，PFS時(shí)間指從隨機(jī)化開始到患者現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間。

表1 GEO和TCGA公共數(shù)據(jù)庫中HCC及癌旁正常組織中HMGB2 mRNA表達(dá)水平的比較

表2 不同臨床病理特征的HCC組織中HMGB2 mRNA表達(dá)水平的比較

*：數(shù)據(jù)有缺失

圖1 HMGB2 mRNA高、低表達(dá)組OS(上)、PFS(下)生存曲線

2.1.2 GSEA分析 GSEA 結(jié)果提示HMGB2 高表達(dá)樣本富集到細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、RNA降解等基因集，見圖2。

從上到下依次為細(xì)胞周期(FDR=0.06)、DNA復(fù)制(FDR=0.12)、RNA降解(FDR=0.14)、錯(cuò)配修復(fù)(FDR=0.20)

圖2GSEA分析結(jié)果

2.2HMGB2蛋白在HCC細(xì)胞中的表達(dá)見圖3和表3、4。Western bolt結(jié)果顯示，SMMC7721和Hep3B細(xì)胞中HMGB2蛋白表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞LO2；轉(zhuǎn)染HMGB2 siRNA的SMMC7721、Hep3B細(xì)胞中HMGB2蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和NC組。

圖3 HMGB2蛋白的檢測(cè)

2.3 3組細(xì)胞增殖、侵襲能力的比較轉(zhuǎn)染HMGB2 siRNA 之后，SMMC7721和Hep3B的增殖、侵襲能力均低于NC組和空白對(duì)照組，見圖4、5和表3、4。

圖4 細(xì)胞增殖曲線

圖5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

2.4 3組細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡率的比較見表3、4。HMGB2 siRNA 轉(zhuǎn)染的SMMC7721和Hep3B細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞凋亡率高于NC組和空白對(duì)照組。

表3 3組SMMC7721細(xì)胞HMGB2蛋白表達(dá)水平、穿膜細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞周期和凋亡率的比較

*:與空白對(duì)照組和NC組相比，P<0.05

表4 3組Hep3B細(xì)胞HMGB2蛋白表達(dá)水平、穿膜細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞周期和凋亡率的比較

*:與空白對(duì)照組和NC組相比，P<0.05

3 討論

HCC是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，早期無明顯不適，且極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵襲和復(fù)發(fā)，診斷和治療難度很大[14]。大多數(shù)患者在確診時(shí)已是晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，因此，探索能夠提示早期HCC的分子指標(biāo)具有重要臨床意義。

HMGB2是較為保守的HMGB家族成員，有報(bào)道[15]認(rèn)為高表達(dá)的HMGB2 在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用，但在成人主要在淋巴器官和睪丸中表達(dá)。此外，在關(guān)節(jié)表面區(qū)域的軟骨細(xì)胞中HMGB2亦高表達(dá)，敲除HMGB2基因后極易發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎[16]。近年來，多項(xiàng)研究證明HMGB2 在胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胰腺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Li等[11]發(fā)現(xiàn)沉默HMGB2后，胃癌細(xì)胞MKN45的增殖能力被抑制，PCNA和Ki-67表達(dá)減少。Wu等[17]的研究表明HMGB2促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲，并與預(yù)后生存相關(guān)。Cai等[18]證實(shí)沉默HMGB2后，胰腺癌細(xì)胞增殖能力下降，并且HMGB2參與維持胰腺癌細(xì)胞的糖酵解進(jìn)程。

本研究利用GEO和TCGA數(shù)據(jù)集證實(shí)HMGB2 mRNA在HCC組織中高表達(dá)，并且與甲胎蛋白表達(dá)水平、TNM分期、分化程度有關(guān)，即惡性程度越高，HCC組織中HMGB2 mRNA的表達(dá)越高。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中HMGB2 mRNA的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系密切，高表達(dá)患者預(yù)后差，這與Kwon等[19]的研究結(jié)果一致。有報(bào)道[20]稱細(xì)胞周期的調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有密不可分的關(guān)系，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受損導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖、凋亡異常、侵襲性增加。本研究利用GSEA方法發(fā)現(xiàn)，HMGB2 mRNA的表達(dá)與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、 RNA降解等有關(guān)，推測(cè)HMGB2可能是通過參與細(xì)胞周期調(diào)控和侵襲轉(zhuǎn)移影響HCC細(xì)胞的生存。我們進(jìn)一步利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HMGB2蛋白在HCC細(xì)胞SMMC7721和Hep3B中高表達(dá)；利用siRNA下調(diào)SMMC7721和Hep3B細(xì)胞中HMGB2的表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力受到抑制，侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡率升高；G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)減少，G2/M期細(xì)胞亦減少。這些結(jié)果再次提示HMGB2 有可能成為HCC臨床預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，并可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，HMGB2的異常表達(dá)可能與HCC細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等密切相關(guān)，可作為一個(gè)潛在的HCC發(fā)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為HCC靶向治療提供了一定參考價(jià)值。