章 菊，葉書來，張昌龍，周 倩

（中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥 230001）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高，而目前HCC的治療處于瓶頸階段，對于早期HCC患者，手術(shù)切除是最有效的治療方法，然而，大多數(shù)HCC患者被診斷時已為中晚期，治療效果差，生存期短。免疫治療是一種非常有前途的治療策略，在肝癌中的研究也取得了一定的進展[1-2]。

最近外泌體（exosomes）的發(fā)現(xiàn)及其多效生物活性引起了研究者們廣泛關(guān)注，目前被廣泛用于疾病診斷和作為藥物輸送車的研究。近年來，也有大量研究表明腫瘤細胞來源的外泌體有刺激樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）成熟的效應(yīng)[3]。但是也有研究表明，來自腫瘤的外泌體有抑制骨髓DCs分化的效應(yīng)[4]。兩種研究結(jié)果的不一致性可能是由于外泌體的來源和所處環(huán)境不同導(dǎo)致所發(fā)揮的作用不同。本研究將來源于HCC細胞的外泌體與DCs共孵育，發(fā)現(xiàn)DCs表面分子上調(diào)，DCs誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖并介導(dǎo)肝癌細胞的特異性殺傷效應(yīng)，此外DCs誘導(dǎo)T淋巴細胞對肺癌細胞A549有一定的殺傷作用。提示HCC細胞的外泌體可能是以DCs為基礎(chǔ)的肝癌或其他腫瘤免疫治療潛在的抗原譜。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人肝癌細胞系HepG2和人肺癌細胞A549購自中國科學(xué)院細胞庫，培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，100 U/mL青-鏈霉素，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。DCs來源于人外周血單核細胞，培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和終濃度為50 ng/mL的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）、白介素 4（recombinant human interleukin，rhIL-4）。高糖DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自澳大利亞Clark公司，rhGM-CSF和rhIL-4購自PeproTech，淋巴細胞分離液Ficoll和單個核細胞分離液Percoll購自美國GE公司，抗體FITC-anti-CD86、PE-anti-CD80、PE-anti-CD83購自美國BD 公 司 ， 抗 體 CD63、 CD81、 Calnexin、 HSP70、HSP90 和 甲 胎 蛋 白 （α-fetoprotein， AFP）購 自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取 收集HepG2細胞上清于50 mL貝克曼離心管中，3 000 g離心15 min，除去細胞碎片，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管，1×104g離心30 min，收集上清液并用0.22μm過濾頭過濾，將濾液置新的50 mL專用貝克曼超速離心管，1×105g離心1 h，小心棄去上清，收集管底部的沉淀顆粒，用大量PBS重懸這些小顆粒，1×105g重復(fù)離心1 h。BCA法蛋白定量后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 用PBS溶解蛋白制備外泌體懸浮液，將20μL外泌體在室溫下置于銅網(wǎng)格上1～2 min，濾紙輕輕吸去周圍過多的液體，室溫下用12%磷鎢酸負染色1～2 min，室溫下用2%戊二醛固定5 min。隨后用PBS洗滌該網(wǎng)格3次，每次3 min，白熾燈下晾干，于透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)。

1.2.3 Western blot檢測外泌體蛋白 將外泌體直接加入蛋白裂解液RIPA，含1 nmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）冰 上 裂 解 10 min，經(jīng)BCA法蛋白定量后，取20μg加入上樣緩沖液，100℃沸水中煮10 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉，分別加入1∶500稀釋的CD63、CD81、HSP70、HSP90和AFP相應(yīng)的一抗，4℃過夜，經(jīng)二抗孵育顯影后曝光。

1.2.4 DCs的誘導(dǎo) 取健康志愿者外周血200 mL經(jīng)Ficoll和Percoll密度梯度離心分離后得到外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），將細胞培養(yǎng)于含有10%FBS、終濃度為50 ng rhGM-CSF和rhIL-4的1640培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3天半量換液，第5天全量換液。第6天加入外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.2.5 外泌體沖擊DCs對T淋巴細胞增殖的影響 健康志愿者外周血經(jīng)Ficoll分離得到PBMC，經(jīng)磁珠分離得到T淋巴細胞，將5μmol/L熒光染料羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxynuorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）標(biāo)記的淋巴細胞與各組DCs以5∶1比例共培養(yǎng)5 d。實驗分3組即空白淋巴細胞組、未成熟DCs與淋巴細胞共培養(yǎng)組、外泌體沖擊后DCs與淋巴細胞共培養(yǎng)組。流式細胞術(shù)檢測各組細胞增殖，收集CFSE陽性細胞，左側(cè)區(qū)域為CFSE熒光強度逐漸減弱的增殖淋巴細胞。

1.2.6 Annexin-V/PI雙染法檢測外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷效應(yīng) 將HepG2和A549作為靶細胞，T淋巴細胞為效應(yīng)細胞，分別按效∶靶細胞25∶1混合，共孵育24 h。實驗分為4組即HepG2細胞組、未成熟DCs與細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）共培養(yǎng)后+HepG2細胞組、外泌體沖擊后DCs與CTL共培后+HepG2細胞組、外泌體沖擊后DCs與T淋巴細胞共培后+A549組。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，在流式細胞儀的散點圖上，Annexin-V陽性細胞群為凋亡細胞群。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組比較采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下肝癌Hep G2細胞來源的外泌體結(jié)構(gòu)

來源于肝癌細胞株HepG2的外泌體，經(jīng)透射電鏡捕獲到一組直徑30～120 nm的小杯狀圓形囊泡，散在或成團分布，見圖1。

圖1 電鏡下肝癌細胞HepG2來源的外泌體結(jié)構(gòu)（×150 000）

2.2 Western blot檢測外泌體中蛋白表達情況

外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、CD81及熱休克蛋白HSP70、HSP90和肝癌抗原AFP均有表達，細胞蛋白Calnexin在HepG2中檢測到表達，在外泌體中未檢測到表達，提示該小囊泡為真正的外泌體（見圖2）。

圖2 HepG2細胞及其外泌體中相關(guān)蛋白的表達

2.3 外泌體沖擊DC的形態(tài)和表型

外周血來源的單核細胞經(jīng)rhIL-4和rhGM-CSF誘導(dǎo)分化成未成熟DCs（圖3A）；外泌體與DCs共培養(yǎng)48 h后可見大部分細胞體積增大，懸浮生長，細胞邊緣有樹突樣突起，DCs朝向成熟分化（圖3B）。經(jīng)流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DCs表面分子CD80、CD83、CD86的表達明顯上調(diào)（圖4）。

圖3 未成熟DCs和成熟DCs（×40）

圖4 DCs表面分子表達

2.4 外泌體沖擊DCs對T淋巴細胞增殖的影響

外泌體與DCs共培養(yǎng)組誘導(dǎo)初始T細胞增殖顯著高于未成熟DCs組以及T淋巴細胞空白組（P均＜0.01）。見圖5。

圖5 肝癌細胞株HepG2外泌體沖擊DCs對T淋巴細胞增殖的影響

2.5 外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL體外腫瘤殺傷效應(yīng)

結(jié)果顯示，與HepG2細胞和未成熟DCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)組比較，外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL對肝癌細胞有明顯的殺傷作用（P＜0.01）。且對其他腫瘤細胞如肺癌細胞A549也有明顯的殺傷效應(yīng)（P＜0.01），見圖6。

圖6 外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL體外特異性和非特異性的殺傷腫瘤效應(yīng)

3 討論

由于肝臟獨特的免疫耐受性，HCC的治療干預(yù)面臨著挑戰(zhàn)。基于DCs的免疫治療在人類試驗中顯示出良好的前景[5]，抗原來源的選擇對DCs介導(dǎo)的免疫療法至關(guān)重要。腫瘤細胞裂解物曾經(jīng)作為抗原，是激活基于DC的免疫治療有吸引力的策略，但在肝癌患者中的反應(yīng)率相對較低[6]，腫瘤來源的外泌體攜帶廣譜抗原可以觸發(fā)CTL交叉抗腫瘤效應(yīng)[7]，作為非細胞的外泌體用于基于DCs的免疫治療引起了廣泛關(guān)注。

以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療處于廣泛臨床研究階段[8]，腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是尋找高效的腫瘤抗原制備成DCs疫苗。研究表明DCs被腫瘤抗原肽沖擊，如甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）[8]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican 3，GPC-3）[9]和黑色素瘤相關(guān)抗原 1（melanoma antigen-1，MAGE-1）[10]，雖然顯示一定的抗腫瘤效應(yīng)，但是療效有限。研究表明單個抗原肽很難引發(fā)免疫反應(yīng)并有免疫逃逸的風(fēng)險[11]，此外，該方法僅限于腫瘤相關(guān)抗原明確鑒定的腫瘤。為了克服這些限制，研究者們試圖使用其他方法，例如使用腫瘤細胞裂解物來沖擊DCs，第一次在人類肝癌患者使用肝癌細胞裂解物作為抗原沖擊DCs，雖然取得一定的療效，但是患者反應(yīng)依然有限[12]。導(dǎo)致低效率的潛在原因尚不清楚。據(jù)報道腫瘤細胞衍生的抑制性因子[如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），白介素 10（interleukin，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和生物因子（如半乳糖凝集素-1、吲哚胺2，3-雙加氧酶和脂滴）]可抑制DCs成熟和T細胞活化[13-14]，這可能有助于解釋接種腫瘤細胞裂解物制備的DCs疫苗缺少效率的原因。因此，尋找具有較強免疫原性同時含較少免疫抑制性物質(zhì)的腫瘤抗原是開發(fā)基于DCs免疫治療迫切需要的。

外泌體被認為是由多泡小體與細胞質(zhì)膜融合后釋放到細胞外的一種膜泡[15-16]，直徑約30～150 nm，含有多種功能蛋白、mRNA和miRNA[17]，外泌體的蛋白質(zhì)組成很大程度上反映了它們親代細胞的蛋白質(zhì)組成[18]，顯示出特異性的細胞類型[7]。與全細胞裂解物相比，在腫瘤來源的外泌體中觀察到富含腫瘤抗原如Melan-A[19]、Silv[7]、癌胚抗原[20]和間皮素[21]，實際上大多數(shù)腫瘤細胞釋放的外泌體都含有腫瘤抗原，提示可以開發(fā)基于腫瘤外泌體的腫瘤疫苗。先前對腫瘤來源外泌體的研究集中于包括誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡和抑制NK細胞殺傷活性等一系列不利影響[22]，然而，越來越多的臨床和實驗結(jié)果表明腫瘤來源的外泌體攜帶大量的腫瘤抗原可激活DCs細胞，提高抗腫瘤免疫[23]。實際上，腫瘤來源的外泌體已經(jīng)被作為腫瘤抗原脈沖DCs，導(dǎo)致腫瘤抗原轉(zhuǎn)移到DCs，在小鼠中能夠誘導(dǎo)CD8+T細胞依賴的抗腫瘤作用[33]?；谶@種矛盾的觀點一方面可能是在腫瘤進展的不同階段腫瘤細胞分泌的外泌體所含有的內(nèi)容物不同發(fā)揮作用不同，腫瘤細胞在發(fā)展或消退的過程都需要經(jīng)歷促腫瘤和抗腫瘤的平衡打破，另一方面外泌體在體內(nèi)和體外所處的環(huán)境不同作用也會有差異。本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤的外泌體攜帶大量的腫瘤相關(guān)抗原和熱休克蛋白如HSP90、HSP70。Srivastava等[24]已經(jīng)證明，源自人類腫瘤細胞質(zhì)的HSP70（HSP70及HSC70）和HSP90（gp96）可以激活T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。腫瘤的HSP是攜帶腫瘤抗原肽的伴侶蛋白，但是否是外泌體刺激DC成熟的關(guān)鍵蛋白還有待于進一步探討。

DCs的成熟伴隨著主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）類分子和共刺激分子的上調(diào)，DCs表現(xiàn)出有效的免疫原性表型，其特征在于釋放IL-12[25]，分泌IL-12的DCs能觸發(fā)強效T（Th1）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）為主的免疫反應(yīng).[26]。我們的研究結(jié)果與此相一致，用外泌體沖擊的DCs能夠上調(diào)他們的CD分子的表達，介導(dǎo)T淋巴細胞增殖。因此來自HCC細胞的外泌體可能是調(diào)節(jié)DCs介導(dǎo)抗腫瘤免疫的重要抗原性物質(zhì)。

CTL在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。一些報道顯示腫瘤來源的外泌體構(gòu)成了一種有效的腫瘤抗原遞送系統(tǒng)，體外誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL的殺傷效應(yīng)并且在體內(nèi)提供抗腫瘤的交叉保護[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)外泌體沖擊DCs體外誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖并介導(dǎo)強烈的特異性腫瘤殺傷效應(yīng)，與此同時，我們還發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)了一定的非特異性殺傷效應(yīng)。因此推測HCC細胞的外泌體可以提供廣譜的腫瘤抗原或免疫原性物質(zhì)，可能為基于DCs的肝癌或其他腫瘤免疫治療提供潛在的腫瘤抗原譜。