任春艷, 于曙光, 馬圓圓, 吳言凌， 師進生

(青島農(nóng)業(yè)大學 化學與藥學院, 山東 青島 266109)

1 實驗項目和實驗原理

近年來,為提高大學生科技創(chuàng)新能力和科技創(chuàng)新意識的大學生科技創(chuàng)新項目在各大高校中得到大力推廣。學生通過走進實驗室,參與教師的科研項目,不僅開闊了眼界,接觸到了許多前沿科技,而且可以把課本上學到的理論和實驗現(xiàn)象、實驗結論相結合,從而達到使理論指導實驗,實驗反過來驗證理論的目的[1-2]。我校應用化學專業(yè)大二學生剛剛學習了儀器分析課程中的流動注射,在儀器分析實驗課程中學習了金屬離子檢測,我們試圖通過該實驗把二者有效地結合,提高分析方法的靈敏度,減少試劑使用量,盡量實現(xiàn)金屬離子的現(xiàn)場實時測定。

微流控芯片是把一整套化學分析實驗室濃縮放到一個幾平方厘米的小芯片上,加入壓力使液體流動,從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)進行化學實驗分析的目的[3]。由于微流控芯片技術具有試劑消耗少、測試速度快、儀器質(zhì)量輕等優(yōu)點,近年來在化學、環(huán)境科學、生命科學、食品科學等學科中得到了廣泛應用[4-6]。而建立在微流控芯片基礎上的微流動分析技術,克服了傳統(tǒng)流動分析技術試劑用量大、產(chǎn)生廢液多、實驗管路又長又粗等缺點,實驗的精密度和靈敏度也有所提高?；瘜W發(fā)光分析法常與流動注射結合使用[7-9],魯米諾-H2O2體系是最常用的發(fā)光體系之一,催化劑(如金屬陽離子)會特別迅速地加快其反應速率[10-11],從而在幾十秒內(nèi)就可以使發(fā)光強度達到最大?；谝陨显?本文提出一種建立在微流控芯片基礎上的微流動注射技術,采用鉻離子催化魯米諾- H2O2體系發(fā)光,通過測定發(fā)光強度檢測水體中的痕量鉻離子。

混合對一個化學反應是最基本的,也是最重要的,尤其對微流控芯片這樣一個只有幾平方厘米的體系而言。其用于反應的通道很窄,只有幾百微米,所用的試劑量也極少,只有幾十微升,因而反應液之間的混合至關重要。本文設計并制作了一種雙扇形微流控芯片,第一個扇形結構有效增加了通道長度,提高了混合效果,第二個扇形結構使發(fā)光區(qū)域面積增大,可有效增大反應靈敏度,從而實現(xiàn)對水體中鉻的實時測定。

2 實驗過程

2.1 玻璃芯片的設計及制作

學生在接到科研任務后,首先查閱了大量相關文獻,再經(jīng)過與教師的討論,決定采用傳統(tǒng)光刻和濕法刻蝕技術合成微流控芯片。經(jīng)過繪圖—曝光—顯影—除鉻—刻蝕—切割—除鉻—鍵合等一系列步驟,在本院實驗室中成功制作了玻璃微流控芯片,其通道結構如圖1所示。為驗證該芯片的混合效果,利用恒流泵分別將氫氧化鈉溶液和酚酞的乙醇溶液引入芯片,通過體視顯微鏡觀察并記錄微通道中粉紅色液流的寬度,根據(jù)式(1)可計算出微混合器的混合程度[12]。在流經(jīng)第一個扇形結構混合單元后,粉紅色液流就充滿了整個通道,計算可得該微混合器的混合效果達到100%,表明氫氧化鈉和酚酞已全部混合均勻。由此可以證明芯片制作成功,可用于下一步的測試實驗。

(1)

實驗時使魯米諾和H2O2分別由A、B兩入口進入通道,混合后進入第一個扇形結構區(qū)域,隨后在S口注入Cr3+溶液,與魯米諾和H2O2完全混合后,流入第二個扇形結構區(qū),此時鉻離子催化魯米諾-H2O2體系發(fā)光,光電倍增管接收光信號。廢液經(jīng)W口流出。我們設計的微流控芯片中,扇形區(qū)域為回形結構,有效拉長混合長度,其總長為19.5cm,可以充分保證魯米諾和H2O2混合完全。因為扇形結構區(qū)域面積較大,能增大發(fā)光強度,從而可提高檢測結果的靈敏度和精密度。

圖1 扇形構造的微流控芯片(尺寸單位:mm)

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液的配制

(1) 魯米諾母液的配制。分析天平準確稱取0.177 2g魯米諾固體,溶于2mL的1mol/L的NaOH溶液中,溶解后轉移到100mL的容量瓶中,定容刻度,搖勻。該母液應避光冷藏保存。

(2) 過氧化氫母液配制。準確吸取102μL30 %的H2O2溶液于100mL容量瓶中,再加入超純水定容至刻度。避光保存。

(3)Cr3+母液的配制。用分析天平稱取0.2665gCrCl3·6H2O,加入少量硝酸,溶解定容至100mL。由于玻璃瓶對Cr3+有吸附性,所以配好的Cr3+母液需放在塑料瓶中。

2.2.2 實驗方法

實驗所用的魯米諾溶液和過氧化氫溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配,魯米諾溶液可由其儲備液稀釋到實驗所需濃度。首先,向芯片的A、B兩入口通過恒流泵,以一定流速分別通入魯米諾溶液和過氧化氫溶液,在S入口以相應流速通入超純水；等到電腦顯示器上的數(shù)值趨于平穩(wěn)時,通過六通閥注射Cr3+樣品,超純水攜帶Cr3+離子溶液進入到芯片檢測區(qū)；進入檢測區(qū)的Cr3+催化已混合好的魯米諾和H2O2發(fā)生化學發(fā)光,光信號由光電倍增管收集,傳遞到N2000色譜工作站(賽智科技(杭州)有限公司)進行數(shù)據(jù)處理。

3 實驗結果與討論

3.1 條件實驗

3.1.1 反應物含量對化學發(fā)光強度的影響

有諸多因素會影響化學發(fā)光強度數(shù)值,尤其是反應底物的濃度,所以需要對魯米諾和H2O2的含量進行優(yōu)化選擇。利用雙因素實驗,同時調(diào)節(jié)魯米諾和H2O2的質(zhì)量濃度,使之分別在1.0×10-4～8.0×10-4mol/L和4.0×10-3～2.0×10-2mol/L之間,加入1.0×10-10mol/L鉻離子溶液,檢測其化學發(fā)光強度,其結果如表1所示。

由表1可以知道,隨著魯米諾和H2O2質(zhì)量濃度的增大,化學發(fā)光強度逐漸增強,當二者濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L時,發(fā)光強度達到最大。此后隨魯米諾和H2O2濃度繼續(xù)增大,化學發(fā)光強度反而有所下降。這可能是由于魯米諾含量過高時,會有少許魯米諾溶液被吸附在芯片的通路上,從而降低實際參與反應的魯米諾含量；H2O2含量過高時,在堿性環(huán)境下,H2O2會部分被解離生成氧氣離開反應體系,從而減少了參加反應的H2O2的含量。因此,確定使用魯米諾和H2O2濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L。

表1 魯米諾和H2O2的濃度對發(fā)光強度的影響 mV

3.1.2 流速和通道寬度對化學發(fā)光強度的影響

魯米諾和H2O2在有金屬離子參與催化時,反應速度很快,一般在50 s內(nèi)發(fā)生反應發(fā)光,而且此時發(fā)光強度最強,隨后又會減弱。由于此反應的時間很短,因此反應試劑流速的選擇也是相當重要的。同時,相同流速的液體流經(jīng)不同寬度芯片時,也會使單位面積芯片中反應物濃度不同。也就是說,反應物流速和芯片寬度會共同影響發(fā)光強度。因此,固定魯米諾和H2O2濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L,通入1.0×10-10mol/L鉻離子溶液,調(diào)節(jié)魯米諾和H2O2的流速分別為20、40、60、80、100 μL/min,相應調(diào)節(jié)超純水流速,同時采用不同寬度的微流控芯片,其通道寬度分別為100、200、300和400 μm,檢測其化學發(fā)光強度,其結果如表2所示。

表2 液體流速和通道寬度對發(fā)光強度的影響 mV

通道寬度/μm發(fā)光強度液體流速/μL·min-1204060801001002189126120105200662223983803613008534852651850640073301483472453

由表2可知,隨著魯米諾和H2O2流速的加快以及通道寬度的增大,化學發(fā)光強度迅速增大?？赡苁怯捎诹魉俸蛯挾仍黾訒r,將更多的魯米諾和H2O2注入芯片,濃度增大,因而發(fā)光強度增大。但當流速大于60 μL/min,通道寬度大于300 μm后,化學發(fā)光強度開始下降。這可能是由于流速的增加,會讓反應物質(zhì)在微流控芯片測試區(qū)的滯留時間變短,而寬度增加則會使反應物濃度減小,使檢測靈敏度降低。綜合考慮以上各種因素的影響,選擇魯米諾和H2O2的流速為60 μL/min,相應超純水流速為120 μL/min,微流控芯片的通道寬度為300 μm。

3.2 鉻離子的標準曲線及檢出限

在上述實驗條件下,通入不同濃度鉻離子標準溶液,測定其發(fā)光強度。每個試樣平行測定3次,取平均值,以發(fā)光強度對鉻離子濃度作圖得標準曲線,如圖2所示。由圖2可見,線性方程為:I= 1.48 × 1010c+138.3(R2= 0.996,I: 發(fā)光強度(mV),c: Cr3+濃度(mol/L)),線性范圍1.0×10-11～ 1.0×10-8mol/L,跨越3個數(shù)量級。同時對空白試樣連續(xù)進樣7次,計算標準偏差S,隨后用3倍的標準偏差(3S)除以線性方程的斜率,計算得到該方法的檢出限是7.91×10-12mol/L,說明該方法的靈敏度很高。

圖2 Cr3+的標準曲線

3.3 精密度實驗

上述鉻離子的標準曲線和檢出限說明,該方法測定鉻離子準確度和靈敏度均很高,而重復性實驗可以驗證其精密度。由此對質(zhì)量濃度為1.0×10-8mol/L 的鉻離子溶液連續(xù)進樣7次,測定其發(fā)光強度,并通過標準曲線換算濃度,計算標準偏差和相對標準偏差,其結果如表3所示。該方法的標準偏差為3.89×10-10,相對標準偏差為3.81%,精密度良好。

4 結語

本文利用大二應用化學專業(yè)學生的大學生科技創(chuàng)新項目,在普通實驗室中,學生自己設計并制作了扇形結構的玻璃微流控芯片。在保證100%混合效果的基礎上,利用堿性條件下Cr3+催化魯米諾-H2O2發(fā)光體系,采用微流動注射分析法,對水體中的鉻離子進行了測定。所得結果如下:

表3 精密度實驗

(1) 探討了魯米諾濃度、H2O2濃度及流速和微流控芯片通道寬度等實驗條件,對發(fā)光強度的影響,得到最佳實驗條件為:魯米諾濃度為5.0×10-4mol/L,過氧化氫濃度為1.0×10-2mol/L,二者流速為60 μL/min,微流控芯片的通道寬度為300 μm。

(2) 在上述最佳條件下,確定Cr3+的標準曲線I= 1.48 × 1010c+138.3(R2=0.996,I: 發(fā)光強度(mV),c: Cr3+濃度(mol/L)),線性范圍是1.0×10-11～ 1.0×10-8mol/L,線性范圍較大,相關性良好。

(3) 精密度實驗表明,標準偏差和相對標準偏差分別是3.89×10-10和3.81%,檢出限是7.91×10-12mol/L,精密度良好,檢出限很低。

綜上所述,該實驗方法有測定速度快、溶液用量少、儀器簡單、便于攜帶等優(yōu)點,同時實驗準確度、靈敏度和精密度均很高,而檢出限很低,因此是一種十分有前途的測定方法。如能有效去除水體中其余金屬離子的干擾,則有望實現(xiàn)痕量鉻離子的現(xiàn)場測定,同時也為其他金屬離子的檢測提供借鑒。

通過該創(chuàng)新性實驗項目,使大學生參與到教師的科研項目中來,學生學到了很多書本上沒有的知識,知識面得到有效拓寬,對全面提高學生的專業(yè)素養(yǎng)和科研能力起到了很好的作用。