李鐵瑛，張纓

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有氧運動訓練中補充Apelin對骨骼肌AMPK活化及線粒體能量代謝的影響

李鐵瑛，張纓

（北京體育大學 運動生物化學教研室，北京 100084）

目的：探討有氧運動訓練補充apelin對骨骼肌AMPK活化及線粒體能量代謝的影響。方法：1）細胞實驗部分采用小鼠骨骼肌C2C12細胞系作為研究對象，將靶向AMPKα基因的小干擾RNA（AMPKα siRNA）或陰性對照小干擾RNA（Control siRNA）通過脂質體介導轉染細胞。轉染48 h后，進行6 h的饑餓處理，而后在完全培養(yǎng)基中加入apelin-13（100 nmol/L）或者同體積的PBS與細胞孵育6 h。按轉染siRNA和加apelin-13情況，實驗分為Control siRNA+PBS組、Control siRNA+apelin組、AMPK siRNA+PBS組與AMPK siRNA+apelin組。完成干預后，采用Seahorse細胞能量代謝分析系統(tǒng)，測定細胞線粒體基礎呼吸、ATP生成和呼吸功能變化。2）動物實驗部分采用C57BL/6J小鼠做為研究對象，將40只小鼠隨機分為安靜未注射組、安靜注射apelin組、運動未注射組和運動注射apelin組，每組10只。注射apelin組小鼠連續(xù)4周腹腔注射apelin-13（0.1 μmol /kg體重/天）。運動組采用75%左右最大攝氧量強度（1～2周坡度5o，速度15 m/min；3～4周坡度5o，速度20 m/min）、1 h/天、6天/周、持續(xù)4周的跑臺運動。最后一次運動后休息48 h，脫頸處死，取兩側股四頭肌。Western Blotting測定骨骼肌apelin、APJ、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)和COX Ⅳ蛋白表達。結果：1）細胞實驗，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，細胞基礎呼吸率、線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著增加；而AMPK siRNA+apelin組與Control siRNA+apelin組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率顯著降低。2）動物實驗，安靜注射apelin組與安靜未注射組相比、運動注射apelin組與運動未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin、APJ、COX Ⅳ蛋白表達和p-AMPKα/AMPKα比值均顯著增加。結論：外源性補充apelin可顯著增加C2C12細胞AMPK介導的線粒體呼吸功能，并提高有氧運動訓練小鼠骨骼肌apelin/APJ、AMPKα磷酸化和COX IV蛋白表達，提示，有氧運動訓練補充apelin可能對骨骼肌的apelin-AMPK通路及其介導的線粒體能量代謝有一定的積極促進作用。

apelin；AMPK；有氧運動；線粒體；骨骼肌

骨骼肌作為機體最大的能量消耗器官，在運動中發(fā)揮重要的能量代謝調節(jié)作用。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內源性配體（O'Dowd et al.,1993;Katugampola et al.,2001），廣泛表達于人和鼠的脂肪、心臟和骨骼肌等組織器官中（Masri et al.,2005;De Falco et al.,2002），在調節(jié)心血管功能、胰島素分泌、食物和水攝取等方面具有多種生物學效應（Gilbert,2017;Taheri,2002）。近年來apelin/APJ在機體（特別是骨骼?。┠芰看x調節(jié)中的作用引起了人們的關注（Indrakusuma et al.,2015;Bajer et al.,2015）。已有研究報道，急性或者慢性補充apelin可以促進骨骼肌葡萄糖利用、脂肪酸氧化和線粒體生物合成（Isabelle et al.,2011）。并且一些學者認為，apelin是細胞能量感受器——腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的上游調節(jié)者。通常磷酸化AMPKα（p-AMPKα(Thr172)）蛋白表達量表示AMPK激活程度或活性（Li et al.,2017）。Apelin可通過激活AMPK，增加p-AMPKα(Thr172)蛋白表達，提高骨骼肌的線粒體生物合成、糖吸收和脂肪酸氧化（Dray et al.,2008）。但也有報道認為，外源性補充apelin促進骨骼肌線粒體能量代謝物調節(jié)并非依賴于AMPK（Frier et al.,2009）R1765。

運動缺乏是導致肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等的重要風險因素（Booth et al.,2012）。長期有氧運動產生的健康效益至少部分取決于肌肉因子的產生（Son et al.,2018）。新近研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練可增加人體骨骼肌apelin mRNA的表達，apelin被認為是運動產生的肌肉因子（Besse et al., 2014）709-710。然而，在有氧運動訓練中補充apelin對骨骼肌apelin/AJP表達、AMPK活化和線粒體能量代謝的影響，以及AMPK在其中的調節(jié)作用，目前尚未見相關報道。

因此，本研究試圖首先采用C2C12骨骼肌成肌細胞系，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染沉默細胞中的AMPKα，觀察給予apelin對細胞線粒體呼吸功能的影響；而后通過動物實驗，給予小鼠4周有氧訓練并腹腔注射apelin，觀察骨骼肌中apelin、APJ、p-AMPKα和細胞色素C氧化酶亞基IV（COX IV）蛋白表達的變化。本研究將深入探討有氧運動訓練介導apelin調控骨骼肌能量代謝及與AMPK的關系，為有氧運動促進健康的效應機制提供進一步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞實驗

1.1.1 研究對象與方法

C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞系，購自于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 采用AMPKα siRNA轉染C2C12細胞

使用含10% Gibco FBS（Thermo Fisher，USA）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone，USA），于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)C2C12細胞。待細胞生長至80%融合度，PBS清洗3遍，加入0.25%胰蛋白酶消化液，待細胞消化完全，加入2mL新的10% FBS完全培養(yǎng)液制成懸濁液，終止消化。將細胞懸濁液轉移至15 mL離心管內，1 000 rpm轉離心3 min。棄去上清，加入2 mL新的10% FBS完全培養(yǎng)液制成懸濁液，計數(shù)，將懸濁液稀釋成20×104個/mL的密度，按照每孔2.5 mL的量種板至6孔板中。待細胞生長至60%～80%匯合時，按照LipofectamineTMRNAiMAX（Thermo Fisher，USA）操作步驟進行轉染。細胞被分為Control siRNA和AMPKα siRNA組。6孔板每孔RNAiMAX轉染試劑和Control siRNA（SC-37007, Satan Cruz）或AMPK siRNA（SC-45313，Satan Cruz）試劑用量比例為1:1:1，均為9 μL。

1.1.3 C2C12細胞線粒體呼吸功能測定

細胞轉染48 h后，按上述步驟消化細胞，制成細胞懸液；計數(shù)，用新的完全培養(yǎng)基稀釋成密度為16×104個/mL（正常種板密度的80%）的細胞懸濁液。進而，細胞種板到美國Seahorse XFe細胞能量代謝分析系統(tǒng)（Seahorse Bioscience，USA）配套特制的96孔板中，室溫放置1 h后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至80%左右，將培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基換成DMEM，進行6 h細胞饑餓處理。之后，將Control siRNA和 AMPK siRNA組細胞進一步分為加入PBS和apelin-13（Sigma，USA）組。PBS和apelin-13組每孔內分別加入20 ul PBS和20 ul apelin-13溶液（濃度為100 nmol/L），孵育6 h。6 h后取出96孔板，按照Seahorse說明書步驟操作，測定C2C12細胞線粒體呼吸功能。其中采用的藥品濃度分別為：寡霉素（Oligomycin，2μmol/L）、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP，1μmol/L）、抗霉素（Antimycin，1μmol/L) 和魚藤酮（Rotenone，1μmol/L）。

1.2 動物實驗

1.2.1 對象與分組

健康8周齡的C57BL/6J小鼠40只[購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證:SCXK(京)2015-0001]，體重18±2 g。將小鼠隨機分為安靜組和運動組，進一步再分別分為未注射apelin組（No apelin，N）和apelin-13（Sigma，USA）apelin注射組（Apelin，A），每組10只。

Apelin注射組采用腹腔注射方式給予apelin，注射劑量為0.1μmol/kg體重/天。注射時間為每天11:00，持續(xù)28天。運動組采用75%左右最大攝氧量強度（1～2周坡度5o，速度15 m/min；3～4周坡度5o，速度20 m/min），1 h/天，6天/周，持續(xù)4周的跑臺運動。安靜組不施加任何運動負荷，正常飼養(yǎng)。

小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，室內溫度20℃～25℃，相對濕度50%～70%，光照12 h/天（7:00～19:00），采用國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由進食和飲水。最后一次運動后休息48 h，脫頸處死。取兩側股四頭肌，迅速稱量，錫紙包裹，標記編號，立刻投入液氮。取材完成后，轉入-80℃冰箱，保存待用。

1.2.2 Western blotting測定蛋白表達

取50 mg骨骼肌加入500 μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher，USA）的RIPA裂解液（碧云天，中國）中。使用勻漿機充分勻漿，于冰上靜置30 min，其間每隔10 min渦旋振蕩10 s；4℃、12 000 rpm離心30 min；取樣品上清即為總蛋白，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

采用BCA蛋白濃度試劑盒（Thermo Fisher，USA）測定骨骼肌的總蛋白濃度。按照每個樣品上樣蛋白總量20 μg，計算上樣體積。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（Life technologies，USA），電泳分離目的蛋白及內參。而后，采用轉膜膠（iBlot?2 NC Regular Stacks，USA）于iBlot Gel Transfer System（Life technologies，USA）轉膜。5%的脫脂牛奶封閉1 h，加一抗于層析柜中孵育過夜。一抗稀釋比例依次為apelin（1:1 000，Satan Cruz，SC-33823），APJ（1:1 000，Satan Cruz，SC-29341），AMPKα（1:500，Satan Cruz，SC-74461），p-AMPKα(Thr172)（1:1 000，Satan Cruz，SC-33524），COX Ⅳ（1:2 000，Abbkine，A01060），內參β-actin（1:1 000，Santa Cruz，SC-47778）。次日，1×TBST洗膜3次，每次10 min。之后加1×TBST稀釋的二抗，二抗稀釋比例：羊抗兔（1:40 000，Thermo Fisher，31460）、羊抗小鼠（1:40 000，Thermo Fisher，31430）。室溫搖床搖晃孵育1 h。1×TBST洗膜3次，每次10 min。條帶加ECL western blot substrate（Life technologies，USA）發(fā)光液，放入曝光機（Bio-Rad ChemiDocTMXRS+，USA）曝光。用儀器自帶分析軟件，讀取條帶相對灰度值，計算結果。其結果計算公式如下：

1.3 統(tǒng)計方法

使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，采用雙因素方差分析數(shù)據(jù)，實驗結果用±表示。＜0.05表示統(tǒng)計學上有意義，＜0.05表示有顯著性；＜0.01表示有非常顯著性。

2 實驗結果

2.1 細胞實驗

圖1 各組細胞線粒體呼吸功能

Figure 1. Mitochondrial Oxygen Consumption Rate

注：*和**分別表示與相應未注射組相比P＜0.05和P＜0.01；下同。

Figure 2. Apelin Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

圖3 各組小鼠骨骼肌APJ蛋白相對表達量

Figure 3. APJ Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

圖1A是Seahorse測定線粒體氧化速率過程示意圖。由圖1B可知，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體基礎呼吸率顯著增加；AMPK siRNA+apelin組與AMPK siRNA+PBS組相比，基礎呼吸率顯著增加。由圖1C、D可知，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著增加；且AMPK siRNA+apelin組與Control siRNA+apelin組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著降低。

2.2 動物實驗

2.2.1 骨骼肌apelin蛋白相對表達

由圖2可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin蛋白表達顯著增加；運動注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin蛋白表達也顯著增加。

2.2.2 骨骼肌APJ蛋白相對表達

由圖3可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌APJ蛋白表達顯著增加；運動注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌APJ蛋白表達顯著增加。

2.2.3 骨骼肌AMPKα、p-AMPKα蛋白相對表達及其比值

圖4 各組小鼠骨骼肌AMPKα、p-AMPKα蛋白相對表達量及其比值

Figure 4. AMPKα、p-AMPKα Protein Expression and their Ratio in Skeletal Muscle of Mice

由圖4C可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌p-AMPKα/AMPKα比值顯著增加；運動注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌p-AMPKα/AMPKα比值顯著增加。

2.2.4 骨骼肌 COX Ⅳ蛋白相對表達

圖5 各組小鼠骨骼肌COXⅣ蛋白相對表達量

Figure 5. COX Ⅳ Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

由圖5可知，運動注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌COX Ⅳ蛋白表達顯著增加。

3 分析討論

3.1 AMPK在apelin調節(jié)C2C12細胞線粒體呼吸功能中的作用

Apelin能夠調節(jié)骨骼肌中的線粒體氧化能力及其生物合成。實驗表明，apelin 能夠增強線粒體能量代謝。高脂飲食小鼠連續(xù)腹腔注射apelin-13（0.1 μmol/kg體重/天）28天后，離體測定小鼠離體的比目魚肌氧耗量。結果表明，apelin注射組的氧耗量顯著高于PBS組（Attane et al.,2012）。1 μmol/L的apelin孵育24 h后，脂肪細胞中的PGC-1α、COX I和SDHA等線粒體生物合成相關蛋白表達顯著增加（Than et al.,2014）。采用普通大鼠連續(xù)2周腹腔注射apelin-13，其股三頭肌中的檸檬酸合酶、COX IV和β-羥酯酰輔酶A脫氫酶（β-HAD）的活性顯著增加，并且核編碼線粒體蛋白基因和線粒體編碼的COX IV和COX I表達也顯著增加（Frier et al.,2009）R1764。高脂飼養(yǎng)apelin 轉基因（TG）和野生（WT）鼠20周后，TG鼠比WT鼠的骨骼肌線粒體數(shù)量顯著增加，且肌纖維中I型（氧化型）肌纖維比例顯著提高（Yamamoto et al.,2011）860-861。

AMPK是機體能量代謝調節(jié)中心，而線粒體是細胞的能量工廠。研究表明，AMPK可以通過調節(jié)線粒體數(shù)量和提高線粒體內的酶活性等途徑增強線粒體能量代謝（Abbott et al.,2014; Marcinko et al.,2014; Wu et al.,1999）。關于apelin調節(jié)骨骼肌能量代謝是否通過AMPK作用，目前仍有爭議（Frier et al.,2009R1765; Bertrand et al.,2015）。本細胞實驗結果顯示，AMPK siRNA+apelin與Control siRNA+apelin組相比，ATP轉換率和最大呼吸能均顯著降低。表明AMPK沉默顯著可降低apelin補充介導的C2C12細胞線粒體呼吸功能，AMPK可直接參與apelin對C2C12細胞能量代謝的調節(jié)。另外，AMPK siRNA+PBS組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體呼吸功能無顯著性變化。這一結果與他人的一些研究相一致（Wang et al.,2014; Fentz et al.,2015）。一篇采用脂肪細胞的研究，通過AMPKα siRNA敲低脂肪細胞發(fā)現(xiàn)，其線粒體呼吸功能與正常脂肪細胞無差異（Wang et al.,2014）。另一篇對AMPK敲除小鼠的動物實驗表明，AMPK敲除鼠每日耗氧量和呼吸交換率與野生鼠相比也無顯著性差異（Fentz et al.,2015）。以上結果均表明，無外源性補充apelin的狀態(tài)下，沉默AMPKα對線粒體呼吸功能影響不大。

3.2 有氧運動訓練補充apelin對骨骼肌apelin、AMPKα磷酸化和COX IV表達的影響

3.2.1 有氧運動訓練和apelin補充對骨骼肌apelin/APJ的影響

APJ作為apelin的受體，其在組織中的表達變化與apelin基本一致。文獻已表明，apelin轉基因小鼠、補充apelin或敲除apelin基因，其骨骼?。╕amamoto et al.,2011）859、血管內皮（Strohbach et al.,2018）、心肌細胞（Bi et al.,2018）、黃體細胞（Ró?ycka et al.,2018）、脂肪細胞（Than et al.,2014）等組織中，APJ蛋白表達量隨apelin表達量增減而變化。盡管新近研究表明，運動可引起apelin mRNA表達增加，被認為是新發(fā)現(xiàn)的運動引起的肌肉因子（Besse et al.,2014709-712; Yang et al.,2015），但目前的研究結果并不完全相同。例如，有研究報道，Zuker大鼠進行6周跑臺耐力運動訓練后，比目魚肌中的apelin蛋白表達顯著性降低，而趾長伸肌中apelin蛋白表達未發(fā)生變化（Son et al.,2017）。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，無論注射apelin還是未注射apelin，4周有氧訓練小鼠股四頭肌中apelin和APJ的蛋白表達并未發(fā)生顯著變化。推測這是否與4周有氧運動的時間不足或取材的肌纖維類型不同時間點有關，但仍有待進一步確定。

進而，無論是安靜還是運動組，補充apelin均可促進骨骼肌apelin和APJ的蛋白表達。說明在本實驗中補充apelin（0.1 μmol/kg體重/天，28天）比運動訓練對骨骼肌apelin/ AJP蛋白表達的作用更強。

3.2.2 有氧運動訓練補充apelin對骨骼肌AMPKα磷酸化和COX IV表達的影響

已有一些文獻報道，外源性補充apelin可增加骨骼肌AMPKα磷酸化蛋白表達（Yue et al.,2010; Vinel et al.,2018）。在本實驗中的研究結果與其一致，并且在運動訓練中補充apelin同樣可促進AMPKα活化。COX IV是線粒體中電子傳遞鏈的末端酶，催化電子從細胞色素C轉移到氧，對線粒體能量代謝至關重要（Oliva et al.,2015）。AMPK可調節(jié)COXIV的表達，進而增強線粒體的呼吸功能（Ritchie et al.,2014）。本研究中有氧運動訓練補充apelin，可進一步增加骨骼肌COX IV蛋白表達，表明有氧運動訓練補充apelin可能通過骨骼肌apelin/APJ-AMPK活化-COX IV蛋白表達這一信號通路，對線粒體進行調節(jié)作用。

4 結論

外源性補充apelin可顯著增加C2C12細胞AMPK介導的線粒體呼吸功能，并提高有氧運動訓練小鼠骨骼肌apelin/ APJ、AMPKα磷酸化和COX IV蛋白表達。提示，有氧運動訓練補充apelin可能對骨骼肌的apelin-AMPK通路及其介導的線粒體能量代謝有一定的積極促進作用。

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Effects of Apelin Supplement during Aerobic Training on AMPK Activation and Mitochondrial Energy Metabolism in Skeletal Muscle

LI Tieying, ZHANG Ying

Objective:To investigate the effects of apelin supplement during aerobic training on AMPK activation and mitochondrial energy metabolism in skeletal muscle. Methods: In the cell experiments, the AMPKα specific small interfering RNA（AMPKα siRNA）or a negative control interfering RNA（Control siRNA） were transfected into mice skeletal muscle C2C12 cells by Lipofectamine. Starvation treatment was performed for 6 hours after 48 hours transfection, and then cells were incubated with apelin-13 or PBS for 6 hours in complete medium to observe the changes in mitochondrial basal respiration, ATP production, and respiratory function. In the animal experiments, forty 8-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into four groups (n=10 in each group): sedentary without apelin treatment, sedentary with apelin treatment, exercise training without apelin treatment and exercise training with apelin treatment group. The apelin treatment groups were injected intraperitoneally with apelin-13 at 0.1 μmol/kg/day for 4 weeks. The exercise groups were trained 6 days/week, 1 hour/day for 4 weeks by running on a treadmill at 75% VO2max. 48 hours after the last session of exercise training, the quadriceps were collected. The protein expressions of apelin, APJ, AMPKα, p-AMPKα (Thr172) and COX IV in skeletal muscles was measured by Western Blotting. Results: 1) In the cell experiments, the basal respiration rate, mitochondrial ATP production and maximum respiration rate were significantly increased in the Control siRNA+apelin group compared with the Control siRNA+PBS group, but the mitochondrial ATP production and maximum respiration rate were significantly decreased in the AMPK siRNA+apelin group compared with the Control siRNA+apelin group. 2) In the animal experiments, the protein expression of apelin, APJ, COX IV and the p-AMPKα/AMPKα ratio in skeletal muscles were significantly increased in the apelin treatment groups compared with no apelin treatment groups. Conclusion: The exogenous supplementation of apelin was significantly increased the AMPK-mediated mitochondrial respiratory function in C2C12 cells, and the apelin supplement during aerobic training was also significantly increased the apelin/APJ, COX IV protein expression and the p-AMPKα/AMPK ratio in skeletal muscles. The results suggested that the combination of aerobic exercise training with apelin supplement might activates the apelin-AMPK pathway and improves the mitochondrial energy metabolism in skeletal muscles.

1000-677X(2019)01-0055-06

10.16469/j.css.201901008

2018-11-09；

2018-12-30

國家自然科學基金資助項目(31640044);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助課題(2018XS001)

李鐵瑛(1988-),女,在讀博士研究生,主要研究方向為運動與骨骼肌健康的代謝適應,E-mail:yingyingziying@ 163.com。

張纓(1961-),女,教授,博士,博士研究生導師,主要研究方向運動與骨骼肌健康的代謝適應,E-mail: zhyi9256 @126.com。

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