侯圣林，戰(zhàn)麗彬＊＊，朱博冉，路曉光

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)脾藏象現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)室 南京 210023；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 大連 116001）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是多種病因?qū)е乱让讣せ睿砸认俪鲅?、壞死為主要特征的臨床急癥，因其起病急，病情復(fù)雜，易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）以及肺、肝、腎等多器官功能衰竭綜合征（multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS）等并發(fā)癥，甚至死亡而被廣泛重視[1]。近年來的臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療能顯著降低SAP并發(fā)癥的發(fā)生率、手術(shù)率及病死率[2]。因此，在SAP非手術(shù)治療方案中，中醫(yī)治療承擔(dān)了相當(dāng)重要的角色。中醫(yī)既往將其歸于“胃脘痛”“腹痛”“脅痛”等范疇，多為陽明腑實(shí)證，因飲食不節(jié)、嗜食膏粱厚味、情志郁結(jié)、外感六淫等引起，致肝郁氣滯，溫?zé)崽N(yùn)結(jié)于內(nèi)[3]。大黃附子湯是漢代張仲景所創(chuàng)，由大黃、附子、細(xì)辛三味藥組成。方中大黃性苦寒，可蕩滌腸胃，有瀉下通便之功效；附子、細(xì)辛性溫?zé)幔阶蛹慈霘夥钟秩胙?，與大黃相配伍，寒熱并用，促進(jìn)氣血的并調(diào)，既充分發(fā)揮大黃的瀉下功效，又保護(hù)了病體的陽氣不被破壞，三者合用，寒熱并投，剛?cè)峁矟?jì)，使臟腑通暢、氣血調(diào)和、邪去正安，是中醫(yī)臨床治療SAP等急危重癥的常用方劑[4]?，F(xiàn)代研究表明，大黃附子湯能保護(hù)腺泡細(xì)胞、減輕胰腺及肺臟等器官損傷[5,6]。大黃附子湯對(duì)SAP的防治作用的靶點(diǎn)研究方面取得了一些進(jìn)展，但其作用機(jī)制尚不完全明確，不同通路之間相互交叉和整合作用機(jī)制仍需深入研究。

中醫(yī)學(xué)理論體系的特點(diǎn)是整體觀念和辨證論治，中藥方劑是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相互作用的復(fù)雜體系，在治療復(fù)雜疾病方面具有自身所特有的優(yōu)勢(shì)。但因其成分復(fù)雜，系統(tǒng)龐大，使得中藥的深入研究呈現(xiàn)巨大困難，因此，需要適合的技術(shù)和方法來探討中藥方劑的復(fù)雜作用機(jī)制[7]，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則為復(fù)雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的思路和視角[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物-靶標(biāo)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)性質(zhì)，其研究方式的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)藥的特點(diǎn)不謀而合。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，以分子對(duì)接、藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及網(wǎng)絡(luò)特征分析為基的多靶點(diǎn)整體調(diào)控的思維方法，來深入探究大黃附子湯治療SAP多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，以期更好的揭示該方治療SAP的科學(xué)實(shí)質(zhì)與內(nèi)涵，為臨床運(yùn)用提供參考。

表1 “中藥-成分-靶標(biāo)”基本信息

表2 大黃附子湯治療疾病的關(guān)鍵靶標(biāo)及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù)值

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的工具是中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)（TCM-IP，www.tcmip.cn）v1.0版本，平臺(tái)由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，目前整合了中藥方劑數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)四大數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 大黃附子湯數(shù)據(jù)收集

登錄TCM-IP v1.0工作界面，新建任務(wù)列表，點(diǎn)擊信息設(shè)定，以大黃附子湯的組成“大黃”、“附子”、“細(xì)辛”為中藥名稱，在整合的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。并添加“severe acute pancreatitis”為自定義“重癥急性胰腺炎”靶標(biāo)。

1.3 中藥靶標(biāo)預(yù)測(cè)

在中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)中，選擇“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-中藥靶標(biāo)預(yù)測(cè)”模塊，與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）上市藥物進(jìn)行相似性打分，將相似性分?jǐn)?shù)值調(diào)整至0.8（Score≥0.8），進(jìn)行篩選獲取作用靶標(biāo)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過TCM-IP創(chuàng)建中藥成分與疾病靶標(biāo)之間的相互對(duì)接網(wǎng)絡(luò)圖。以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2倍中位數(shù)為卡值，選取“中藥靶標(biāo)-疾病基因”互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)即Hub節(jié)點(diǎn)以及相關(guān)通路（Pathway），并進(jìn)一步獲取Hub節(jié)點(diǎn)GO（Gene Ontology）富集分析結(jié)果和KEGG富集分析結(jié)果。

1.5 關(guān)鍵靶標(biāo)及通路分析

利用該平臺(tái)對(duì)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)出的關(guān)鍵靶標(biāo)所涉及的基因功能和相關(guān)通路進(jìn)行富集分析，最終獲得“中藥-有效成分-關(guān)鍵藥靶-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 大黃附子湯中所含成分及其預(yù)測(cè)靶標(biāo)概況

通過該平臺(tái)，并將相似性分?jǐn)?shù)值調(diào)整至≥0.8時(shí)，大黃附子湯三味中藥共含有158種成分，659個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)（表1）。

2.2 大黃附子湯化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析

將候選靶標(biāo)按照“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”、“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”三個(gè)拓?fù)涮卣鲄?shù)值進(jìn)行篩選，經(jīng)過篩選后可得到34個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)。其中按節(jié)點(diǎn)連接度、緊密度、節(jié)度值排名前10位顯示在列表中（表2）。關(guān)鍵靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的化合物、中文名稱及所參與主要信號(hào)通路顯示（表3），大黃附子湯可能通過調(diào)節(jié)葡萄糖激酶（CGK）、氨基端激酶（JUN）、人鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白G（GNB1）等關(guān)鍵靶標(biāo)來調(diào)節(jié)重癥急性胰腺炎的發(fā)生與發(fā)展。這些靶標(biāo)與方中大黃化學(xué)成分1-O-沒食子?；?葡萄糖、2-O-肉桂-β葡萄糖、2-肉桂酰葡萄糖、白藜蘆醇苷等，以及和附子化學(xué)成分去甲基棱砂貝母堿、細(xì)辛化學(xué)成分α-異松油烯密切相關(guān)。

表3 大黃附子湯治療SAP關(guān)鍵靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的化合物及所參與主要信號(hào)通路

圖1 大黃附子湯調(diào)節(jié)疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 大黃附子湯調(diào)節(jié)疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

在未進(jìn)行關(guān)鍵靶標(biāo)篩選的情況下，通過該平臺(tái)，可構(gòu)建一個(gè)大黃附子湯治療SAP疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)可視圖（圖1）。

2.4 大黃附子湯治療SAP關(guān)鍵靶標(biāo)的GO和KEGG通路富集分析

根據(jù)該平臺(tái)計(jì)算得出的關(guān)鍵靶標(biāo)的基因功能富集分析結(jié)果顯示，一共含有包括參與調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、MAPK級(jí)聯(lián)激活和白細(xì)胞介素-2結(jié)合等577個(gè)基因功能，彼此相互或交叉作用于111條信號(hào)通路。根據(jù)P-Value排名前10位顯示在結(jié)果中（表4，表5）。

2.5 大黃附子湯治療SAP“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的建立

通過TCM-IP v1.0建立大黃附子湯中治療SAP“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，探討12個(gè)核心藥效成分6個(gè)關(guān)鍵預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)和30條主要通路之間的相互關(guān)系（圖2）。

表4 大黃附子湯治療SAP關(guān)鍵靶標(biāo)GO富集分析列表

表5 大黃附子湯治療SAP關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路信息列表

3 討論

SAP的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜，并且有多因素參與的病理生理過程，所以其發(fā)病機(jī)制至今尚未得到相應(yīng)統(tǒng)一。大量國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生SAP時(shí)血液中的促炎性細(xì)胞因子濃度與病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此炎癥發(fā)生發(fā)展及免疫系統(tǒng)的嚴(yán)重失衡始終影響著疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，若及時(shí)調(diào)節(jié)整個(gè)免疫系統(tǒng)使其維持平穩(wěn)，則是防止疾病重癥化、減少感染及膿毒血癥發(fā)生率、降低SAP死亡率的關(guān)鍵[10,11]。本研究是運(yùn)用TCM-IP v1.0進(jìn)行藥物成分分析及對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。整合藥理學(xué)的概念及其研究思路是由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所許海玉團(tuán)隊(duì)首先提出的[12]，該平臺(tái)運(yùn)用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計(jì)算等方法，是中藥方劑與機(jī)體相互作用研究的有力技術(shù)手段[13]。我們借助這個(gè)平臺(tái)對(duì)大黃附子湯治療SAP的作用機(jī)制進(jìn)行探討，不僅進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其多靶點(diǎn)、多通路作用特點(diǎn)，還獲得不同通路之間相互交叉和整合作用機(jī)制的深入研究。

通過“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”網(wǎng)路圖分析發(fā)現(xiàn)，大黃附子湯中大部分核心藥效成分可通過不同的靶點(diǎn)與同一信號(hào)通路相連接，而同一靶點(diǎn)也可以與不同的信號(hào)通路相連接，說明不同成分的作用靶點(diǎn)之間具有協(xié)同作用；大黃附子湯具有多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的整體調(diào)節(jié)特點(diǎn)，其作用的靶點(diǎn)包括CGK、JUN、ATP1A1和KRAS等，作用的信號(hào)通路涉及炎癥?內(nèi)分泌?細(xì)胞?腫瘤?免疫?信號(hào)傳導(dǎo)等多條代謝通路。目前實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)了大黃附子湯能抑制胰酶釋放，保護(hù)腺泡細(xì)胞，抑制多種細(xì)胞因子釋放[14]。我們通過TCM-IP v1.0的研究可以推斷出，大黃附子湯可通過降低SAP患者IL-2水平，減少胰腺STAT3蛋白表達(dá)，減輕胰腺過度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)胰腺作用。

圖2 大黃附子湯治療SAP“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

綜上所述，通過中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，可以高效的對(duì)大黃附子湯中12個(gè)核心藥效成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)和通路分析，通過建立“核心成分?關(guān)鍵靶標(biāo)?主要通路”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)大黃附子湯藥效成分可能通過抑制多種炎性因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制氨基端激酶磷酸化，并調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫活性發(fā)揮抗SAP作用，提示這些可能是該方治療SAP的潛在機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)然，中藥化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的復(fù)雜性，以及中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)辨證論治的特色優(yōu)勢(shì)，尚需新的技術(shù)和進(jìn)一步的研究來探明其分子機(jī)制，以便更好的為人類醫(yī)學(xué)服務(wù)。