陳學(xué)通，粟 星，黃 超，李 燕，王永華,2＊＊

（1.石河子大學(xué)新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石河子 832000；2.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部 西安 710000）

1 引言

1個(gè)世紀(jì)以來(lái)，藥物研發(fā)的主導(dǎo)范式是針對(duì)單一機(jī)制的單個(gè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)高選擇性、高親和力的藥物。以此為目的，以數(shù)量巨大的化合物庫(kù)為來(lái)源，針對(duì)明確的靶標(biāo)進(jìn)行體外高通量篩選，最終幫助科學(xué)家在較短的時(shí)間內(nèi)篩選出針對(duì)特定藥靶的高親和力候選藥物[1,2]。這些單靶標(biāo)、高選擇性藥物在臨床實(shí)踐中成功得到了應(yīng)用，例如磷酸二酯酶-5抑制劑（例如西地那非），α 1a腎上腺素受體拮抗劑（例如坦索羅辛），選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑（例如塞來(lái)昔布）和激酶特異性抗腫瘤藥（例如伊馬替尼）等藥物。證明了單靶標(biāo)的高選擇性藥物確實(shí)能對(duì)疾病治療起到效果。長(zhǎng)期以來(lái)，受到西方藥學(xué)的影響，中藥學(xué)的大量研究也主要致力于從中藥中尋找高活性、高親和力小分子，期望借此闡明中藥的藥效學(xué)基礎(chǔ)。雖然中藥在臨床上取得了顯著的藥效，卻難以從中藥中發(fā)現(xiàn)高活性、高親和力的小分子。這一矛盾一直困擾著研究者。迫使我們對(duì)傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式進(jìn)行反思，“一個(gè)疾病，一個(gè)靶標(biāo)，一個(gè)藥物”的哲學(xué)是否適用于所有疾病的治療，高選擇性、高親和力為導(dǎo)向的藥物研發(fā)策略是否具有普適性。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明藥物的療效與其靶點(diǎn)的親和力高低并無(wú)必然的聯(lián)系，某些低親和力分子也同樣具有良好的臨床效果。例如阿司匹林。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)藥物往往作用于多個(gè)靶標(biāo)，并展示出較低的親和力（對(duì)靶標(biāo)的抑制常數(shù)大于10-6M）[3]。這表明一個(gè)藥物的療效通常與復(fù)雜的藥理學(xué)相關(guān)聯(lián)，并通過(guò)作用于多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮藥效[4,5]。而針對(duì)當(dāng)前公布的藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，中藥中存在大約有11萬(wàn)個(gè)具有多靶點(diǎn)、弱結(jié)合特性的小分子[6]。如何理解這些分子的治療機(jī)制，并開(kāi)發(fā)合適的藥物篩選技術(shù)是研究者面對(duì)的主要難題。鑒于目前的認(rèn)識(shí)水平和發(fā)展成果，為了重新認(rèn)識(shí)弱結(jié)合分子的重要性以及作用機(jī)制，我們需要重新定義弱結(jié)合藥物，并提出弱結(jié)合藥物研究的新方法和新技術(shù)。

2 中藥“弱結(jié)合－顯效”理論

一直以來(lái)，中藥弱結(jié)合分子作為藥物的發(fā)現(xiàn)來(lái)源被忽視，其原因主要有三點(diǎn)。第一，目前許多科研人員的慣性思維仍然是藥物與靶標(biāo)需要緊密結(jié)合，他們認(rèn)為弱結(jié)合藥物對(duì)其靶標(biāo)不具有特異性，從而會(huì)與多個(gè)非目標(biāo)靶標(biāo)發(fā)生相互作用[7]。第二，認(rèn)為弱親和力的分子對(duì)目標(biāo)的結(jié)合量可能太低而無(wú)法推動(dòng)反應(yīng)。但是，如果局部濃度的弱結(jié)合劑足夠高，它可以推動(dòng)平衡，導(dǎo)致相當(dāng)大的配體結(jié)合。第三，目前的藥物發(fā)現(xiàn)方法無(wú)法篩選或者分析弱結(jié)合藥物或者弱的生物相互作用，比如藥物篩選時(shí)往往只保留分子庫(kù)中抑制常數(shù)為1 μM或者更低的分子，弱結(jié)合分子在多種篩選過(guò)程中被輕易的剔除了[7]。這些因素導(dǎo)致研究者無(wú)法有效的在中藥中發(fā)現(xiàn)弱結(jié)合藥物。

幸運(yùn)的是，我國(guó)藥學(xué)家屠呦呦教授對(duì)青蒿素的研究促進(jìn)了對(duì)弱結(jié)合藥物的認(rèn)識(shí)。2015年屠呦呦教授因?yàn)榍噍锼孬@得了諾貝爾獎(jiǎng)，隨后引發(fā)了青蒿素的研究熱潮。同年，新加坡國(guó)立大學(xué)和南京大學(xué)的研究人員用青蒿素類(lèi)似物鑒定了124個(gè)與青蒿素共價(jià)結(jié)合的蛋白，指出青蒿素作用于多個(gè)靶標(biāo)從而發(fā)揮療效[8]。2016年，上海生命科學(xué)院的研究人員指出青蒿素可能通過(guò)結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)，調(diào)節(jié)多條細(xì)胞通路發(fā)揮協(xié)同抗癌療效[9]。這些案例啟發(fā)我們，在中藥中存在著一類(lèi)分子：在弱結(jié)合的情況下，可以通過(guò)作用于多個(gè)靶標(biāo)達(dá)到治療效果。

研究者在中藥的研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象。針對(duì)細(xì)胞炎癥模型MAPK通路的4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)ERK、JNK、p38和MEK1/2，研究者系統(tǒng)地開(kāi)展了藥物抗炎和靶點(diǎn)結(jié)合力的關(guān)聯(lián)研究（天然產(chǎn)物400個(gè)，西藥分子200個(gè)）[10]。結(jié)合力評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)：所有天然產(chǎn)物和上述4個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合自由能均大于-25 kcal·mol-1（弱結(jié)合力），而西藥分子則普遍低于-40 kcal·mol-1（強(qiáng)結(jié)合力）。例如，木犀草素和上述靶標(biāo)的IC50在29.6-300 μM之間，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的靶點(diǎn)選擇性。而西藥PD0325901和MEK1能夠特異性結(jié)合，具有很強(qiáng)的親和力（IC50=0.33 nM）。然而，令人驚訝的是，所有分子中木犀草素的抗炎效果最佳。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素的3個(gè)靶點(diǎn)（JNK+p38和MEK1/2+p38）呈現(xiàn)“并聯(lián)協(xié)同”作用，當(dāng)其協(xié)同增效倍數(shù)超過(guò)一定閾值（CI＜0.9），即可激發(fā)顯著的生物學(xué)表型效應(yīng)（圖1）[10]。此外，研究者在迷迭香酸研究中拓展了該發(fā)現(xiàn)，盡管該分子和 3個(gè)作用靶點(diǎn) ACE，PTGS2，REN（IC50=30-500 μM）呈現(xiàn)弱結(jié)合效應(yīng)，但是由于靶點(diǎn)之間的“串聯(lián)協(xié)同”，使其達(dá)到較好的血管舒張作用[11]。更加重要地，在復(fù)方熱毒寧注射液研究中，發(fā)現(xiàn)了其3個(gè)主要活性成分京尼平、東莨菪亭和綠原酸在采用和注射液同等含量聯(lián)用時(shí)，具有與注射液相當(dāng)?shù)目寡仔Ч?個(gè)成分單獨(dú)使用（與注射液同等含量）則幾乎沒(méi)有抗炎效果[12]。靶點(diǎn)研究表明：這3個(gè)成分分別靶向MAPK通路上下游的緊密聯(lián)系的3個(gè)靶點(diǎn)，即JNK,ERK,c-Jun（IC50均 ＞300 μM），在這條通路上激發(fā)了很強(qiáng)的“串聯(lián)和并聯(lián)協(xié)同”作用，形成了“多分子接力”較強(qiáng)抗炎效果。

以上這些發(fā)現(xiàn)給予研究者巨大啟發(fā)。由于人體內(nèi)復(fù)雜的生網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)單靶點(diǎn)、強(qiáng)結(jié)合藥物在面對(duì)復(fù)雜疾病時(shí)（例如腫瘤、心血管病、阿爾茲海默癥等），無(wú)法取得預(yù)期的療效，而靶向多個(gè)靶點(diǎn)的弱結(jié)合藥物通過(guò)“串聯(lián)和并聯(lián)協(xié)同”等作用站展現(xiàn)出更優(yōu)秀的治療效果。由此我們提出了中藥“弱結(jié)合-顯效”理論：如果一個(gè)中藥單體結(jié)合于多個(gè)靶點(diǎn)且親和力均較低，當(dāng)其作用的靶點(diǎn)之間滿(mǎn)足特定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)條件時(shí)，可產(chǎn)生串聯(lián)或并聯(lián)協(xié)同作用，從而激發(fā)顯著的表型效應(yīng)。這一理論也可以拓展到復(fù)方中多分子互作研究。

3 中藥“弱結(jié)合-顯效”研究評(píng)價(jià)新技術(shù)和新方法

為了重新認(rèn)識(shí)中藥“弱結(jié)合-顯效”的重要性并理解其作用機(jī)制，我們需要在蛋白組尺度上定量和系統(tǒng)分析藥物-靶標(biāo)相互作用，并預(yù)測(cè)藥物的表型反應(yīng)，從而在浩瀚的中藥成分庫(kù)中篩選出符合“弱結(jié)合-顯效”理論的潛在藥物。2007年，英國(guó)Dundee大學(xué)藥理學(xué)家Hopkins首次提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念(Hopkins 2007)，對(duì)藥物研發(fā)的理念、策略和方法產(chǎn)生了深刻的影響?？茖W(xué)家逐漸開(kāi)始從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病發(fā)生過(guò)程、認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)。促進(jìn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、多向藥理學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)等新興學(xué)科蓬勃發(fā)展，為多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 （A）模擬兩個(gè)天然產(chǎn)物木犀草素（LT）和丹參酮IIA（TS）以及選擇性抑制劑PD（MEK抑制劑），F(xiàn)R（ERK抑制劑），SP（JNK抑制劑），SB（p38抑制劑）在10 μM濃度時(shí)對(duì)IL-6和TNF-α生成的抑制效果。這些化合物在10 μM時(shí)對(duì)靶標(biāo)的抑制率由他們的IC50曲線推測(cè)得到。（B）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定的兩個(gè)天然產(chǎn)物和四個(gè)選擇性抑制劑在10 μM時(shí)對(duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α的抑制效果

3.1 實(shí)驗(yàn)測(cè)定弱結(jié)合藥物

考慮目前的實(shí)驗(yàn)篩選方法，篩選弱結(jié)合藥物仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。一般情況，弱結(jié)合藥物或弱的生物相互作用由于篩選上和分析上的困難很少被研究。許多高通量篩選（HTS）試驗(yàn)依賴(lài)于直接檢測(cè)方法，例如熒光反應(yīng)，吸光度或活性率，這可能成為評(píng)價(jià)弱結(jié)合的障礙。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的局限性，高通量篩選過(guò)程會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和陰性結(jié)果，尤其是評(píng)價(jià)存在弱結(jié)合化合物時(shí)。盡管如此，基于酶活抑制試驗(yàn)的高通量篩選如果設(shè)計(jì)合理，仍可以檢測(cè)到半數(shù)抑制濃度（IC50）小于10-4M的弱結(jié)合化合物[13]。此外，還有一些可以篩選弱結(jié)合化合物的潛在方法，例如核磁共振（NMR）[14]，質(zhì)譜（MS）[15]，X-射線晶體照相術(shù)[16]，親和色譜[17]，毛細(xì)管電泳[18]和表面等離子體共振[19]。這些方法在篩選弱結(jié)合藥物方面具有一定的實(shí)用性。但是需要消耗巨大的資源，無(wú)法高效的從中藥巨大的成分庫(kù)中篩選出合適的藥物。我們需要推出新方法和新技術(shù)以解決當(dāng)前弱結(jié)合藥物篩選中遇到的困難。

3.2 計(jì)算方法篩選弱結(jié)合藥物

界定和預(yù)測(cè)弱結(jié)合藥物的多向藥理學(xué)效果需要定量的理解其靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)和功能，還需要了解靶標(biāo)和小分子在生物網(wǎng)絡(luò)環(huán)境下的相互作用[20]。此外細(xì)胞成分之間也通過(guò)類(lèi)似網(wǎng)絡(luò)的方式發(fā)生相互作用進(jìn)而行使功能[21]。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)本身的動(dòng)力學(xué)屬性很大程度上決定了互作分子的生物功能，因此與藥靶有關(guān)的生物網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)可能幫助揭示弱結(jié)合藥物的作用模式[22,23]。許多疾病相關(guān)通路的數(shù)學(xué)模型已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，具有闡明疾病機(jī)制和識(shí)別有效治療策略的潛力[24,25]。分析這些疾病相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)可以發(fā)現(xiàn)潛在藥靶并理解他們之間的互作模式[26,27]。例如，一些特殊的信號(hào)元素，如PI3K，Akt和胰島素受體底物家族[28-30]，是多條信號(hào)通路的重要連接點(diǎn)，已被作為藥物開(kāi)發(fā)中的重要靶標(biāo)。模擬網(wǎng)絡(luò)行為表明部分抑制多個(gè)靶標(biāo)比完全抑制單個(gè)靶標(biāo)更為有效[5]。此外，為了定量分析藥-靶互作，可以從刻畫(huà)藥-靶互作的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)開(kāi)始[31]，然后鑒定靶標(biāo)被藥物結(jié)合后的構(gòu)象和化學(xué)狀態(tài)[32]。這個(gè)過(guò)程主要依靠配體-蛋白的分子對(duì)接（docking）[33]，配體-蛋白復(fù)合體的自由能計(jì)算和分子動(dòng)力學(xué)模擬[34,35]。這些計(jì)算的方法為我們篩選弱結(jié)合藥物提供了一定的思路，但是當(dāng)前并沒(méi)有一個(gè)綜合的方法來(lái)確定中藥中的弱結(jié)合藥物，我們需要提出一個(gè)綜合性的方法和框架來(lái)解決弱結(jié)合藥物的篩選問(wèn)題。

4 基于系統(tǒng)藥理學(xué)的弱結(jié)合分子篩選新方法和新技術(shù)

圖2 網(wǎng)絡(luò)基元?jiǎng)恿W(xué)分析技術(shù)流程圖

為了探索藥理學(xué)新領(lǐng)域并合理設(shè)計(jì)弱結(jié)合藥物，有必要將那些相對(duì)獨(dú)立的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)技術(shù)整合到一個(gè)框架下面。針對(duì)目前篩選有效的多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物過(guò)程中存在的問(wèn)題，研究者有機(jī)的整合通路及網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白組范圍預(yù)測(cè)藥物-靶標(biāo)相互作用以及藥代動(dòng)力學(xué)模型，開(kāi)發(fā)出一種用于尋找多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物的系統(tǒng)方法：基元模塊動(dòng)力學(xué)分析（ESDA:Elementary subgraphs dynamics analysis）方法[10]。該方法，可以有效的預(yù)測(cè)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)對(duì)多點(diǎn)弱擾動(dòng)的響應(yīng)，隨后根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)選擇合適的靶標(biāo)組合，利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)與靶標(biāo)組合發(fā)生互作的化合物并實(shí)驗(yàn)測(cè)定其結(jié)合力以及藥效（圖2）。首先，對(duì)一系列基元模塊進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)研究在多靶藥物作用下的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其次，將基元模塊應(yīng)用到經(jīng)典的MAPK通路尋找最優(yōu)靶標(biāo)組合。再次基于這些靶標(biāo)組合，利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法，從巨大中藥分子庫(kù)中篩選候選的弱結(jié)合藥物。然后，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計(jì)算來(lái)評(píng)價(jià)化合物與靶標(biāo)的親和力，用激酶抑制試驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。最后，在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物候選物的潛在療效。

4.1 弱結(jié)合成分藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)

藥物在經(jīng)過(guò)有機(jī)體的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過(guò)程后，保留在體內(nèi)的活性成分需要靶向生物大分子（DNA、RNA和蛋白質(zhì)）來(lái)發(fā)揮藥效，因此藥物分子的靶標(biāo)識(shí)別是藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。然而目前，只有化學(xué)藥物和少部分的天然產(chǎn)物具有靶標(biāo)信息，大部分天然產(chǎn)物尤其是具有多靶標(biāo)屬性的天然產(chǎn)物其靶標(biāo)仍然不清楚，這顯然阻礙了我們開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物的進(jìn)程。針對(duì)此問(wèn)題，我們創(chuàng)新性的開(kāi)發(fā)了靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)（SysDT）直接根據(jù)小分子的結(jié)構(gòu)信息和靶點(diǎn)的一級(jí)序列信息來(lái)獲得小分子與靶標(biāo)的互作關(guān)系[36]。同時(shí)鑒于蛋白的一級(jí)序列無(wú)法全面反映其與分子的互作信息，進(jìn)一步利用開(kāi)發(fā)的加權(quán)系綜相似度算法（WES）預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物的靶標(biāo)[37]。最后，利用藥-靶激活/抑制模式分析模型（PreAM）預(yù)測(cè)化合物-靶標(biāo)的互作關(guān)系[38]。

靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)（SysDT）是一個(gè)大規(guī)模整合藥物、基因組和藥理學(xué)數(shù)據(jù)信息，借助人工智能技術(shù)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)藥物結(jié)構(gòu)特征和藥理學(xué)表型的多重藥-靶互作分析技術(shù)：1）以DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http://drugbank.ca/）構(gòu)建了一個(gè)包含6511藥物和3987個(gè)靶點(diǎn)的原始藥物-靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)；2）分別用Dragon程序（http://www.talete.mi.it/index.htm）和 ProFeat web sever（http://jing.cz3.nus.edu.sg/cgi-bin/prof/prof.cgi）計(jì)算分子述符和蛋白描述符；3）隨后綜合利用隨機(jī)森林（Random Forest，RF）和支持向量機(jī)方法（Support Vector Ma-chine，SVM）建立了一個(gè)準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)藥物結(jié)構(gòu)特征和靶點(diǎn)藥理學(xué)表型的多重藥-靶互作分析技術(shù)。該方法可以直接根據(jù)分子的結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)出其潛在的靶標(biāo)。

加權(quán)系綜相似度算法（WES），通過(guò)挖掘特定配體群的系綜特征，結(jié)合生理參數(shù)，依靠貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了蛋白分子互作的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)（＞79%）：從BindingDB數(shù)據(jù)庫(kù)中得到包含了inhibitory(Ki)和IC50信息的98327個(gè)蛋白-配體關(guān)系，其中包括1788個(gè)蛋白和68777個(gè)分子；利用CDK程序和Dragon程序計(jì)算分子描述符；識(shí)別出配體中與藥理學(xué)信息相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征；通過(guò)評(píng)估總體相似度（整體）而不是單一的配體判斷來(lái)確定分子和靶標(biāo)的親和性；通過(guò)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)和多變量核心方法整合標(biāo)準(zhǔn)化綜合相似度（Z score）進(jìn)行分子靶標(biāo)預(yù)測(cè)。

藥-靶激活/抑制模式分析模型（PreAM）是運(yùn)用超平面分割技術(shù)來(lái)提取靶點(diǎn)蛋白中參與決定互作模式的結(jié)構(gòu)因子，并整合化合物藥效團(tuán)特征的新策略構(gòu)建的一個(gè)高準(zhǔn)確率的藥物激活/抑制算法：來(lái)自DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)的獲得6006個(gè)已知激活/抑制信息的藥物-靶標(biāo)關(guān)系，其中包括1251個(gè)激活關(guān)系和4755個(gè)抑制關(guān)系；分別用Dragon程序（http://www.talete.mi.it/index.htm）和 ProFeat web sever（http://jing.cz3.nus.edu.sg/cgi-bin/prof/prof.cgi）計(jì)算分子述符和蛋白描述符；利用隨機(jī)森林（Random Forest，RF）的方法訓(xùn)練出一個(gè)藥物-靶標(biāo)的激活/抑制信息分類(lèi)器并用于新化合物-靶標(biāo)互作關(guān)系的預(yù)測(cè)。

綜合上述3個(gè)模型預(yù)測(cè)出化合物的潛在的靶標(biāo)，并為后續(xù)的多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

4.2 弱結(jié)合藥物多靶點(diǎn)擾動(dòng)模擬

針對(duì)特定的疾病機(jī)制開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物，首先需要了解該疾病機(jī)制所涉及的功能蛋白或信號(hào)分子等要素，同時(shí)需要了解這些要素所處的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)環(huán)境。細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的平衡原則使得細(xì)胞對(duì)分子擾動(dòng)具有彈性的同時(shí)又具有對(duì)微妙的輸入信號(hào)的敏感性。洞悉這種機(jī)制或許能夠利用細(xì)胞的控制回路加快多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物的開(kāi)發(fā)進(jìn)程，獲得藥效更好、劑量更低和耐藥機(jī)率更少的藥物[39]。在生物網(wǎng)絡(luò)中，絕大部分成分都不是孤立的，或多或少的與其他成分具有關(guān)聯(lián)，相互促進(jìn)或者制約，使得系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)的平衡。但不論網(wǎng)絡(luò)多么復(fù)雜，可能只存在為數(shù)不多網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能夠有力的執(zhí)行任何特定的生物學(xué)功能，那些存在較少參數(shù)約束的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能更為有利。根據(jù)生化細(xì)節(jié)和進(jìn)化歷史，相同的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)核心組可能是細(xì)胞行為的基礎(chǔ)[40,41]。因此，在面對(duì)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的生物網(wǎng)絡(luò)，有必要對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化，抽提出核心組件方便我們進(jìn)行分析和運(yùn)用。當(dāng)前，一些科學(xué)家利用少數(shù)節(jié)點(diǎn)來(lái)簡(jiǎn)化復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并模擬外界因素對(duì)這種簡(jiǎn)化網(wǎng)絡(luò)的干擾，歸納總結(jié)了一些基本的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)單元并研究他們的拓?fù)鋵W(xué)和動(dòng)力學(xué)特性[42-45]。

由此，我們?cè)谇叭搜芯抗ぷ鞯幕A(chǔ)上進(jìn)行總結(jié)和擴(kuò)展，構(gòu)建了一系列三成份的基元模塊（elementary subgraphs），基本包含了3個(gè)成份之間所有可能的互作方式。隨后用數(shù)學(xué)模型來(lái)模擬這些基元模塊動(dòng)態(tài)行為，幫助我們更清晰的理解他們的結(jié)構(gòu)特征。最終，我們提取出了33種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的核心組件（基元模塊）：由兩個(gè)靶標(biāo)和一個(gè)下游效應(yīng)器構(gòu)成的三成分拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。根據(jù)這些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的特點(diǎn)進(jìn)行了分類(lèi)，按照結(jié)構(gòu)分成了串聯(lián)模塊和并聯(lián)模塊兩大類(lèi)，包括11個(gè)串聯(lián)模塊和22個(gè)并聯(lián)模塊。隨后運(yùn)用常微分方程對(duì)這些基元模塊進(jìn)行了模型構(gòu)建，并假定存在兩種靶標(biāo)抑制劑對(duì)基元模塊進(jìn)行擾動(dòng)。模擬這些基元模塊在多點(diǎn)擾動(dòng)下的響應(yīng)情況來(lái)探索哪些基元模塊存在協(xié)同效應(yīng)，而哪些基元模塊是拮抗效應(yīng)，并且探索動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)這些協(xié)同/拮抗模塊的影響。最終，我們根據(jù)模擬結(jié)果將基元模塊分為18個(gè)非參數(shù)依賴(lài)模塊和15個(gè)參數(shù)依賴(lài)模塊（圖3）。這些模塊為理解復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的基本特征提供了一種方法，并為篩選弱結(jié)合藥物的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞯於嘶A(chǔ)。

4.3 弱結(jié)合藥物最優(yōu)靶標(biāo)組合

針對(duì)一個(gè)特定的分子網(wǎng)絡(luò)開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)藥物，首先要面對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，動(dòng)力學(xué)參數(shù)多變，多途徑之間反饋、串?dāng)_等困難。在沒(méi)有弄清楚分子網(wǎng)絡(luò)的特征之前，針對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的若干節(jié)點(diǎn)開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)藥物是盲目的。原因在于分子網(wǎng)絡(luò)的魯棒性和冗余性，不恰當(dāng)?shù)臄_動(dòng)靶標(biāo)組合往往得不到有效的系統(tǒng)響應(yīng)，甚至產(chǎn)生不利影響。開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物首先要解決的就是靶標(biāo)組合的選擇問(wèn)題，基于優(yōu)化的靶標(biāo)進(jìn)行藥物篩選不僅能夠獲得具有良好藥效的候選化合物，還能夠避免產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題。

圖3 對(duì)33個(gè)基元模塊的進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬分析協(xié)同效果

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是眾多生物反應(yīng)通路中的一種，是生物體最基本也最重要的組成要素，幾乎所有的生命現(xiàn)象都與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展具有直接或間接的關(guān)系[46]。了解信號(hào)通路的特征有利于我們有目的性的開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物。在眾多的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中，MAPK信號(hào)通路是一個(gè)在進(jìn)化上相當(dāng)保守并且被廣泛研究的信號(hào)通路，它在調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)應(yīng)激和炎癥的響應(yīng)方面扮演著重要角色[47,48]。因此，我們利用前人實(shí)驗(yàn)獲得的和自己估計(jì)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)常微分方程構(gòu)建了濃縮的MAPK信號(hào)通路模型（圖4）。并基于網(wǎng)絡(luò)基元模塊理論，在這個(gè)真實(shí)的生物網(wǎng)絡(luò)中探尋符合非參數(shù)依賴(lài)或參數(shù)依賴(lài)的基元模塊以獲得最優(yōu)靶標(biāo)組合。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，我們首選選取了該信號(hào)通路中的經(jīng)典藥靶進(jìn)行組合擾動(dòng)，以?xún)煞N炎性因子的生成量來(lái)評(píng)估系統(tǒng)響應(yīng)情況。擾動(dòng)模擬包括了對(duì)單靶標(biāo)的強(qiáng)擾動(dòng)，對(duì)串聯(lián)模塊靶標(biāo)的弱擾動(dòng)以及對(duì)并聯(lián)模塊的弱擾動(dòng)。最后根據(jù)下游炎性因子生成受到抑制的程度選擇合理的靶標(biāo)組合，發(fā)現(xiàn)對(duì)3個(gè)串聯(lián)模塊多點(diǎn)弱擾動(dòng)后，只有組合抑制MKK3/6和p38表現(xiàn)出對(duì)IL-6和TNF-α理想的抑制效果，而對(duì)于12個(gè)并聯(lián)模塊，同時(shí)抑制ERK和p38表現(xiàn)出對(duì)IL-6和TNF-α最好的抑制效果。此外，多點(diǎn)弱擾動(dòng)的5個(gè)最優(yōu)靶標(biāo)組合中都含有p38，表明針對(duì)MAPK信號(hào)通路開(kāi)發(fā)多靶標(biāo)弱結(jié)合抗炎藥時(shí)，優(yōu)先考慮含有p38的靶標(biāo)組合。

4.4 弱結(jié)合藥物篩選與驗(yàn)證

當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)手段篩選多靶標(biāo)弱結(jié)合化合物存在很大挑戰(zhàn)，用計(jì)算模擬的方法作為輔助手段可以降低多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物篩選的難度，節(jié)約時(shí)間和提高成功率。為此。當(dāng)前，我們利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法中的靶標(biāo)預(yù)測(cè)模型和互作類(lèi)型預(yù)測(cè)模型對(duì)中藥中全部小分子進(jìn)行了靶標(biāo)和互作方式預(yù)測(cè)，根據(jù)MAPK信號(hào)通路靶標(biāo)組合反向篩選獲得了32個(gè)多靶標(biāo)化合物，這些化合物大部分被報(bào)道具有抗炎活性，一定程度上說(shuō)明我們的前期的工作的可靠性。其次我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬以及結(jié)合自由能計(jì)算的方法初步評(píng)價(jià)候選化合物與靶標(biāo)的親和力。隨后選取木犀草素與丹參酮IIA作為多靶標(biāo)弱結(jié)合化合物，以幾種激酶抑制劑作為單靶標(biāo)強(qiáng)結(jié)合化合物對(duì)照，進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，在酶學(xué)水平上木犀草素和丹參酮IIA對(duì)其靶標(biāo)的IC50在微摩爾濃度范圍，遠(yuǎn)大于現(xiàn)有的激酶抑制劑，但是在細(xì)胞抗炎實(shí)驗(yàn)中顯示出與激酶抑制劑相當(dāng)甚至更好的藥效。

綜上所述，我們系統(tǒng)地分析了網(wǎng)絡(luò)基元模塊的性質(zhì)，并利用基元模塊選取信號(hào)通路中的最優(yōu)靶標(biāo)組合，隨后基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選出多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物。這些結(jié)果，表明基于系統(tǒng)藥理學(xué)篩選多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物是一種切實(shí)可行的方法，可以為新藥開(kāi)發(fā)、老藥新用，天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

圖4 數(shù)學(xué)模擬MAPK信號(hào)通路

5 中藥“弱結(jié)合-顯效”理論和方法在活血化瘀機(jī)制的驗(yàn)證和應(yīng)用

活血化瘀是中醫(yī)的一個(gè)重要理論和治療原則。研究者以典型血瘀型冠心病為切入點(diǎn)，著眼于“弱結(jié)合-顯效”這一新視角，從中藥作用靶點(diǎn)，起效模式等方面出發(fā)，以川芎、丹參和三七典型活血化瘀中藥為例開(kāi)展研究。發(fā)現(xiàn)了這些草藥共同作用于冠心病相關(guān)靶點(diǎn)13個(gè)且結(jié)合力均較弱（IC50＞300 μM）。例如川芎內(nèi)酯（ligustilide）與PTGS2，GABRA1串聯(lián)協(xié)同抗血栓形成；丹參素A（salvianic acid A）與蛋白凝血因子X(jué)a（F10），ADRB1，PPARγ和NOSs結(jié)合，并聯(lián)協(xié)同促進(jìn)血管舒張[49]。這種“弱結(jié)合-顯效”模式在銀杏葉治療中風(fēng)的活血化瘀機(jī)制中得到進(jìn)一步證明[50]。此外，基于“弱結(jié)合-顯效”理論和方法，研究者闡明了紅花和山楂等單味藥治療CVD效果不顯著的原因：其主要活性成分黃杉素、丁香脂素、原紫草酸等與CVD的主要靶點(diǎn)ERB，PPAR為弱結(jié)合（＞500 μM）且不符合顯效協(xié)同模式。結(jié)合前期構(gòu)建的CVD靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（CVDSP，http://lsp.nwu.edu.cn/cvdsp.php），發(fā)現(xiàn)了丹參酮VI，黃杉素和丁香脂素3個(gè)分子的靶點(diǎn)滿(mǎn)足協(xié)同增效的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)條件，由此確定了一個(gè)治療缺血型冠心病最優(yōu)組合：“紅山丹”（紅花+山楂+丹參，最佳質(zhì)量比為1∶1∶2），在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上達(dá)到和同類(lèi)西藥相當(dāng)?shù)寞熜51]。

6 結(jié)論與展望

開(kāi)發(fā)高親和力的選擇性配體是過(guò)去幾十年藥物開(kāi)發(fā)的主導(dǎo)方式。然而由強(qiáng)效的先導(dǎo)化合物獲得的藥物候選物往往在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中具有較高的失敗風(fēng)險(xiǎn)率。同時(shí)，分析市售的高親和力藥物和天然產(chǎn)物表明療效與高親和力并無(wú)必然聯(lián)系。從經(jīng)典的蛋白折疊到近來(lái)代謝、基因調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最新發(fā)現(xiàn)，都表明在分子水平上，弱的相互作用在生物系統(tǒng)的分子識(shí)別中扮演著重要角色。以網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，弱相互作用有利于生物網(wǎng)絡(luò)的魯棒性和多樣性，因此集體的弱相互作用可能比單一的強(qiáng)相互作用對(duì)生物系統(tǒng)更具深刻的影響。

設(shè)計(jì)有效多靶標(biāo)弱結(jié)合藥物的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題或許是在復(fù)雜細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中尋找合適的靶標(biāo)組合。盡管實(shí)驗(yàn)工具例如高通量篩選有希望發(fā)現(xiàn)弱結(jié)合藥物，但通常是耗費(fèi)時(shí)間且效率低下，而且呈指數(shù)增長(zhǎng)的潛在藥物靶標(biāo)組合也使實(shí)驗(yàn)工具無(wú)法滿(mǎn)足需要。合適的計(jì)算模型和算法以及豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，能有效的減少尋找潛在靶標(biāo)組合的搜尋空間。因此，系統(tǒng)的整合計(jì)算工具與實(shí)驗(yàn)策略可以有效識(shí)別弱結(jié)合化合物，實(shí)現(xiàn)弱結(jié)合藥物在治療不同疾病表型上的全部潛力。

天然產(chǎn)物和他們的組合通常作用于多種藥物靶標(biāo)，這些靶標(biāo)包括并超出了目前FDA批準(zhǔn)藥物的有限靶標(biāo)空間，因此具有相當(dāng)大的治療潛力。從這些天然材料里獲取的弱結(jié)合藥物真正有機(jī)會(huì)在發(fā)揮最大療效的同時(shí)最大限度的降低副作用。我們提出了一種可靠的方法來(lái)識(shí)別多靶標(biāo)弱結(jié)合化合物。由于這種方法可以作為高親和力藥物研發(fā)的補(bǔ)充，我們可以想象更多的療法將會(huì)被重新發(fā)現(xiàn)。因此，如果更多的科學(xué)家開(kāi)發(fā)藥物時(shí)不單是考慮緊密結(jié)合到蛋白上的化合物，同時(shí)也關(guān)注弱結(jié)合或者瞬時(shí)結(jié)合到多個(gè)靶標(biāo)的小分子，新的藥物開(kāi)發(fā)將具有充滿(mǎn)希望的美好未來(lái)。