錢文娟，林麗麗，汪受傳，狄留慶，單進(jìn)軍＊＊

（1.江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210023）

寒、熱作為反映疾病性質(zhì)的一對(duì)綱領(lǐng)，在指導(dǎo)疾病的診斷、治療過(guò)程中起著重要的作用。代謝組學(xué)可通過(guò)現(xiàn)代生物分析方法及生物信息分析策略研究生物樣本中代謝物的變化，尋找生物標(biāo)志物，進(jìn)而在代謝物及代謝通路水平上闡釋中醫(yī)寒、熱證型的實(shí)質(zhì)，并建立精準(zhǔn)量化的“證”的標(biāo)準(zhǔn)。本文總結(jié)了近年來(lái)基于代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)寒、熱證型實(shí)質(zhì)的研究，對(duì)所存在的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了分析與展望。

1 寒、熱證型簡(jiǎn)介

寒熱理論源于《內(nèi)經(jīng)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》的“陽(yáng)勝則熱，陰勝則寒”，《素問(wèn)·五常政大論》提出“治熱以寒，溫而行之；治寒以熱，涼而行之”；自《傷寒論》起逐步完善，開(kāi)創(chuàng)方藥，如半夏瀉心湯、大青龍湯、黃土湯等；確立于宋元明清等多位醫(yī)家著作，并不斷繼承創(chuàng)新至今，是貫穿于中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論的重要綱領(lǐng)，涉及中醫(yī)病、癥、證、治各個(gè)方面。

寒證，是疾病的本質(zhì)屬于寒性的證候，可以由感受寒邪所致，也可以由機(jī)體自身陽(yáng)虛陰盛而致，表現(xiàn)為機(jī)體機(jī)能活動(dòng)衰減的證候。包括表寒、里寒、虛寒和實(shí)寒等證。寒證往往表現(xiàn)為無(wú)熱、惡寒、下利、不渴、小便清長(zhǎng)、手足厥冷、面色蒼白、脈象微細(xì)等。熱證可以由外感陽(yáng)熱之邪或寒濕等邪化熱，或氣郁化熱，或食積化熱等陽(yáng)盛陰虛所致，表現(xiàn)為機(jī)體機(jī)能活動(dòng)亢進(jìn)的證候。包括表熱、里熱、虛熱和實(shí)熱等證。熱證常表現(xiàn)為高熱、便閉、口渴喜飲冷、小便短赤、顏面潮紅，脈象洪數(shù)等。

2 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)的核心內(nèi)容。基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組為生物過(guò)程提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而代謝組信息則提示生物進(jìn)程中已經(jīng)發(fā)生的物質(zhì)改變[1]。代謝組學(xué)分析流程包括樣本收集及預(yù)處理、檢測(cè)分析及數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理及解釋。代謝組學(xué)研究對(duì)象是小分子內(nèi)源性代謝物，樣本包括體液（血液、尿液、唾液、淋巴液[2]、腦脊液[3]、關(guān)節(jié)腔液[4]等）、細(xì)胞、組織、糞便[5]等生物樣本。常用的代謝組學(xué)分析工具主要是質(zhì)譜（MS）、液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）和核磁共振技術(shù)（NMR）等。其中色譜具有分離度高、檢測(cè)效率高等特點(diǎn)；質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)高選擇性和低檢測(cè)限；核磁共振具有非破壞性、非選擇性的優(yōu)勢(shì)。數(shù)據(jù)處理的基本策略是化學(xué)計(jì)量學(xué)和多元統(tǒng)計(jì)結(jié)合[6]，對(duì)多維大數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和歸類分析，并根據(jù)P值、Fold Change值和VIP值篩選顯著改變的代謝物。同時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用代謝數(shù)據(jù)庫(kù)如NIST、HMDB、KEGG等搜尋代謝物相關(guān)生物功能及代謝通路，確定與疾病密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物（群）和代謝通路。

3 代謝組學(xué)與中醫(yī)寒、熱證型實(shí)質(zhì)的關(guān)聯(lián)

中醫(yī)“證”是對(duì)當(dāng)前病因、病位、病性、病勢(shì)等全局性的、病理性的概括。因此，對(duì)于中醫(yī)寒、熱證型實(shí)質(zhì)的研究需從整體的角度出發(fā)?！白C”的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化研究歷來(lái)是中醫(yī)研究的熱點(diǎn)[8]。從古至今，臨床中醫(yī)證型主要由醫(yī)者的主觀經(jīng)驗(yàn)判定，很難標(biāo)準(zhǔn)量化。臨床科研研究采用流行病學(xué)的方法，將中醫(yī)“望聞問(wèn)切”四診所獲得的信息進(jìn)行整理，總結(jié)出一些普遍性的臨床癥狀，建立診斷標(biāo)準(zhǔn)。但是這種診斷的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)，影響了“證”標(biāo)準(zhǔn)的可靠性與準(zhǔn)確性[9]。因此，需要建立整體的、精準(zhǔn)量化的中醫(yī)“證”的標(biāo)準(zhǔn)。

代謝組學(xué)，具有整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用到探索寒、熱證型的科學(xué)內(nèi)涵中來(lái)。其通過(guò)高分辨、高通量、高靈敏度的分析手段，定性或定量監(jiān)測(cè)體液、組織或細(xì)胞、菌群中內(nèi)源性小分子物質(zhì)（分子量＜1 kDa），探索機(jī)體在受到外部環(huán)境或疾病狀態(tài)影響下的動(dòng)態(tài)變化，并找到潛在生物標(biāo)志物（群）及相關(guān)代謝通路[10,11]。運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)可從代謝物及代謝通路角度闡釋中醫(yī)寒、熱證的本質(zhì)，并建立精準(zhǔn)量化的“證”的標(biāo)準(zhǔn)。

4 臨床寒、熱證實(shí)質(zhì)的代謝組學(xué)研究

近年來(lái)，臨床上運(yùn)用代謝組學(xué)研究疾病的寒、熱證型取得了重要進(jìn)展，所研究的疾病類型多，涉及呼吸系統(tǒng)疾?。ㄟ^(guò)敏性鼻炎、肺炎、支氣管哮喘）、痛經(jīng)、關(guān)節(jié)炎、肝炎、腎炎、胃病、銀屑病及亞健康等。研究人員首先根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)篩選研究對(duì)象并分組。在診斷標(biāo)準(zhǔn)中，包括疾病西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)、中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)及病例納入排除標(biāo)準(zhǔn)。其次是樣本采集，臨床上采集的樣品主要是晨起空腹血和尿。最后利用GC-MS、LC-MS及1H-NMR技術(shù)對(duì)寒證患者及健康志愿者，熱證患者及健康志愿者或同一疾病下寒、熱證型的患者的生物樣本進(jìn)行分析，監(jiān)測(cè)出寒、熱證代謝譜的差異，獲得與人體疾病、證型分類密切相關(guān)的生物標(biāo)志物（群）。關(guān)于寒、熱證型的臨床代謝組學(xué)研究見(jiàn)表1。綜合寒、熱證代謝譜中顯著性改變的代謝物可見(jiàn)，氨基酸、糖、脂質(zhì)、脂肪酸及胺類的代謝紊亂，主要參與的代謝通路有氨基酸合成、氮代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙氨酸，天冬氨酸、谷氨酸代謝、酮體合成和降解、?；撬岷蛠喤；撬岽x、半乳糖代謝、糖酵解和糖異生及丙酮酸代謝等，同一證型下不同疾病的代謝物改變趨勢(shì)不同，如原發(fā)性痛經(jīng)的寒證證型中，虛寒和實(shí)寒的患者與正常機(jī)體間的差異性代謝物均有乳酸、葡萄糖、果糖、異檸檬酸、甘氨酸、原藻醇和馬尿酸，但是代謝趨勢(shì)相反；又如虛寒證中，過(guò)敏性鼻炎的代謝組學(xué)研究中肌醇的含量顯著升高，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的代謝組學(xué)研究中，肌醇的含量顯著降低，提示“虛、實(shí)”證、不同疾?。ā芭K、腑”）可影響寒、熱證代謝表型，影響寒、熱證型實(shí)質(zhì)的研究。

5 動(dòng)物模型寒、熱證實(shí)質(zhì)的代謝組學(xué)研究

中醫(yī)證候動(dòng)物模型是在中醫(yī)整體觀念及辨證施治思想的指導(dǎo)下，運(yùn)用臟象學(xué)說(shuō)和中醫(yī)病因、病機(jī)理論，在動(dòng)物體上模擬和復(fù)制人類各種臨床癥候[12]。建立相應(yīng)的中醫(yī)證候動(dòng)物模型，分析其生物樣本，篩選出中醫(yī)證候相關(guān)生物標(biāo)記物，有利于進(jìn)一步探索寒、熱證型實(shí)質(zhì)，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。一般將造模方法劃分為西醫(yī)病因病理造模、中醫(yī)病因病機(jī)造模和病癥結(jié)合造模3類，具體的造模方法多樣，包括使用生化制品或中藥制劑、調(diào)控飼養(yǎng)環(huán)境、情志刺激等[13]。在動(dòng)物模型寒、熱證的代謝組學(xué)研究中（表2），動(dòng)物模型多樣，包括西醫(yī)病因病理模型如干酵母熱證模型；中醫(yī)病因病機(jī)模型如寒冷環(huán)境聯(lián)合冰水游泳及寒冷飲食的外寒內(nèi)飲證模型和病癥結(jié)合模型如高糖高脂、高溫高濕聯(lián)合大鼠腹腔注射產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的大腸濕熱模型。動(dòng)物模型中顯著改變的代謝物主要是氨基酸、糖、脂質(zhì)、脂肪酸及胺類等，代謝物主要參與的代謝通路有TCA循環(huán)、甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酸合成等，但是同一疾病模型不同的造模方式所獲取的代謝物改變趨勢(shì)不同，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒證模型中，采用卵蛋白聯(lián)合低溫冷凍造模方法時(shí)，代謝物亮氨酸含量顯著升高，棕櫚酸含量顯著降低，而使用牛Ⅱ膠原蛋白聯(lián)合弗氏完全佐劑造模方法時(shí)，亮氨酸含量則顯著降低，棕櫚酸含量顯著升高，提示采用動(dòng)物模型研究寒、熱證實(shí)質(zhì)時(shí)，代謝組學(xué)研究所篩選得到的寒、熱證潛在生物標(biāo)記物（群）和代謝通路還不能直接用于揭示人體寒、熱證實(shí)質(zhì)。

表1 臨床寒、熱證的代謝組學(xué)研究

續(xù)表1

表2 動(dòng)物模型寒、熱證代謝組學(xué)研究

續(xù)表2

6 問(wèn)題與展望

目前代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于探索中醫(yī)寒、熱證型實(shí)質(zhì)并取得一定成就，但依然存在問(wèn)題：（1）單純使用一種分析儀器或方法，只能得到部分代謝物的信息，致使同一樣本應(yīng)用不同分析方法找出的生物標(biāo)記物（群）不同。因此，需結(jié)合多種分析技術(shù)進(jìn)行代謝物全譜的檢測(cè)：可采用LC-MS技術(shù)和NMR技術(shù)相結(jié)合[14]，GC-MS技術(shù)和LC-MS技術(shù)聯(lián)合[15]，綜合非靶向和靶向代謝組學(xué)模式[16]，增強(qiáng)代謝物檢測(cè)覆蓋率。（2）寒、熱證動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)仍處于探索階段，對(duì)于動(dòng)物證候模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)及可重復(fù)性存在爭(zhēng)議，證候動(dòng)物模型對(duì)人體臨床證候的模擬程度也未得到公認(rèn)。因此，對(duì)造模動(dòng)物進(jìn)行代謝組學(xué)研究所篩選得到的寒、熱證潛在生物標(biāo)記物（群）和代謝通路還不能直接用于揭示人體寒、熱證實(shí)質(zhì)，仍需進(jìn)一步結(jié)合臨床研究。（3）同一證型下不同疾病所得潛在生物標(biāo)記物（群）種類差別大，且回調(diào)趨勢(shì)不一致，難以解釋寒、熱證型規(guī)律及實(shí)質(zhì)。因此，需采用代謝組學(xué)聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)研究方法，從基因-轉(zhuǎn)錄-蛋白-代謝角度整體探索寒、熱證實(shí)質(zhì)。