吳敬敬，馬虹瑩，王丹丹，葛廣波＊＊，楊 凌＊＊

（1.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 大連 116044；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院 上海 201203）

中草藥以其獨(dú)特的療效在中國(guó)乃至世界的醫(yī)療保障體系中占有非常重要的地位。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，大約世界人口的80%都在使用草藥作為治療手段[1]。然而，近年來，有關(guān)中草藥誘發(fā)毒性的報(bào)道日趨增多，使中草藥安全性問題成為醫(yī)患及社會(huì)共同關(guān)注的焦點(diǎn)[2-4]。中草藥毒性主要分為直接毒性和草藥-藥物相互作用兩大類。藥物代謝是人體防御外來物侵襲的重要機(jī)制。一般而言，外源性物質(zhì)通過代謝反應(yīng)會(huì)使母體化合物的生物活性或毒性有所降低，所以被認(rèn)為是減毒的過程。然而，也有相當(dāng)一部分藥物分子經(jīng)代謝會(huì)生成毒性更強(qiáng)的代謝物。在有些情況下，甚至?xí)诖x酶的催化作用下產(chǎn)生親電反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物，這個(gè)過程被稱為代謝激活（metabolic activation）或生物激活（bioactivation）（圖1）。目前報(bào)道的絕大多數(shù)的代謝激活是由細(xì)胞色素P450酶所介導(dǎo)的，僅有少數(shù)由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、磺酸化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等介導(dǎo)[5-7]。代謝激活過程中產(chǎn)生的具有親電活性的代謝中間體，一方面能夠和細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)或核酸，發(fā)生共價(jià)結(jié)合而誘發(fā)毒性；另一方面還會(huì)共價(jià)修飾藥物代謝酶，使其產(chǎn)生不可逆性抑制，從而誘發(fā)嚴(yán)重的藥物-藥物相互作用[8,9]。代謝激活是藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）和上市藥物被撤銷的主要原因[10-13]。統(tǒng)計(jì)表明，在美國(guó)已撤市的藥物中有64%的藥物經(jīng)歷了代謝激活過程[14,15]。目前，代謝激活已經(jīng)成為了國(guó)內(nèi)外中草藥毒性研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，尤其是近期馬兜鈴酸致肝癌的相關(guān)性研究使得中藥安全性再度成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)問題[16]。

圖1 代謝激活的基本過程模式圖

表1 易被P450酶代謝激活的基團(tuán)和相應(yīng)產(chǎn)生的活性代謝中間體

早在2005年，Kalgutkar等人根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)了容易被代謝激活的毒性基團(tuán)[17]（表1）。其中主要包括：芳香胺、酰肼類、芳香硝基物、含氮雜環(huán)化合物、對(duì)苯二酚、亞甲二氧基苯、呋喃等。Samuel等人發(fā)現(xiàn)一個(gè)含有苯氧基的候選藥物在藥物代謝酶的催化作用下會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的代謝激活生成臨醌親電活性中間體，并對(duì)其作了一系列的結(jié)構(gòu)修飾，最終大大降低了其代謝激活的程度[18]。Tang等人發(fā)現(xiàn)含有二氨基吡啶基團(tuán)的化合物很容易經(jīng)歷代謝激活過程，從而形成醌亞胺親電活性中間體。經(jīng)過大量的化學(xué)修飾改造發(fā)現(xiàn)用N-甲基或者氧替換吡啶環(huán)上的2-NH基團(tuán)能夠在不影響藥效的情況下消除代謝激活的現(xiàn)象[19]。本文將針對(duì)P450酶代謝激活的不同中藥化合物及其相關(guān)毒性進(jìn)行綜述。

1 吡咯里西啶類

圖2 吡咯里西啶生物堿的代謝激活過程

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類天然有毒生物堿，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約有400種結(jié)構(gòu)得到確證的PAs，廣泛存在于6000種有花植物中。這些植物的95%以上主要集中于以下4個(gè)科中即菊科（Asteraceae）的千里光屬（Senecio L.）、橐吾屬（Ligularia Cass）、澤蘭屬（Eupatorium）和蜂斗菜屬（Petasites）；紫草科（Boraginaceae）的天芥菜屬（Heliotropium）、琉璃草屬（Cynoglossum）、紫草屬（Lithospermum）和聚合草屬（Symphytum）；豆科（Leguminosae）的豬屎豆屬（Crotalaria）；蘭 科（Orchidaceae）的 羊 耳 蒜 屬（Liparis）。吡咯里西啶生物堿的代謝激活反應(yīng)被認(rèn)為是其毒性產(chǎn)生的一個(gè)非常重要的誘因，其經(jīng)由P450代謝轉(zhuǎn)化形成吡咯-蛋白質(zhì)加合物，從而誘發(fā)肝毒性，這些加合物可作為評(píng)價(jià)PAs毒性的生物標(biāo)志物[20]。

肝臟中多種藥物代謝酶都參與了吡咯里西啶生物堿的代謝反應(yīng)，其中細(xì)胞色素P450參與的代謝激活反應(yīng)被認(rèn)為是其致毒的一個(gè)關(guān)鍵的步驟[21]。吡咯里西啶類生物堿的發(fā)現(xiàn)解釋了千里光、款冬花等中藥發(fā)生肝毒性的原因[22]。不同的PAs毒性差別很大。PAs是千里光次堿酸的單酯或二酯，根據(jù)堿基類型可分為3種類型：倒千里光裂堿型（retronecine-type），奧索千里光裂堿型（otonecine-type）和闊葉千里光裂堿型（platynecine-type）。其中，毒性最弱的是闊葉千里光裂堿型的PAs[20]，具有肝毒性的PAs含有不飽和的堿基[21]。PAs通過P450酶代謝轉(zhuǎn)化形成吡咯-蛋白質(zhì)加合物的活性中間體，從而誘發(fā)肝毒性（圖2）。已有研究表明，僅有CYP3A4和CYP3A5兩種P450亞型酶能夠激活?yuàn)W索千里光裂堿型PA；相比之下，CYP1A1，1A2，2A6，3A4，3A5，2B6，2C9，2C19，2D6，2E1等10余種P450亞型酶均能夠激活倒千里光裂堿型PA，并且參與其代謝激活的P450亞型酶的貢獻(xiàn)也存在很大差異[21]。此外，值得注意的是，N-葡萄糖醛酸化是大多數(shù)吡咯里西啶生物堿的一條共有的代謝途徑，且主要由尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A4介導(dǎo)。已有研究表明，單獨(dú)使用千里光寧（senecionine）并不能誘發(fā)人肝細(xì)胞毒性，而當(dāng)UGT1A4活性受到蕃麻皂抑制后，肝細(xì)胞毒性迅速表現(xiàn)出來，這表明葡糖醛酸化可能是人體抵御其毒性一道重要防御機(jī)制[23,24]。

2 硝基菲類

馬兜鈴酸（aristolochic acid）屬硝基菲類衍生物，是關(guān)木通、廣防己等馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的有效成分，曾在臨床上用于鎮(zhèn)痛消炎、祛痰利尿以及感染性疾病和癌癥的輔助用藥等，從結(jié)構(gòu)上分為馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II，均含有硝基芳烴結(jié)構(gòu)[25]。已有研究表明，馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)中的硝基基團(tuán)為主要的毒性基團(tuán)，甲基和羥基的存在可以進(jìn)一步增強(qiáng)其毒性[26,27]。馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II能夠在CYP1A1/2等多種代謝酶的作用下，硝基基團(tuán)被還原成環(huán)狀的成氮翁離子（nitrenium），后者可以與DNA，尤其是鳥嘌呤和腺嘌呤的氨基基團(tuán)，或者蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成加合物，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死[28-30]。1993年，比利時(shí)學(xué)者在Lancet雜志上首次報(bào)道了含有廣防己和厚樸的減肥丸可引起快速進(jìn)行性間質(zhì)性腎纖維化，并稱此腎病為中草藥腎病[31]。1999年英國(guó)柳葉刀又報(bào)道了兩名婦女因服用含關(guān)木通的草藥茶治療濕疹導(dǎo)致晚期腎衰竭事件[32]。2000年6月美國(guó)聯(lián)邦食品藥物管理局（FDA）采取了嚴(yán)厲措施，對(duì)含馬兜鈴酸成分的藥材和成藥限制使用和進(jìn)口。隨后加拿大、英國(guó)、西班牙、馬來西亞等國(guó)家也發(fā)布了進(jìn)口和銷售含馬兜鈴中藥的禁令。國(guó)家藥品和監(jiān)督管理局于2003年4月1日印發(fā)了取消關(guān)木通藥用標(biāo)識(shí)的通知。

表2 吡咯里西啶類中草藥的代謝激活實(shí)例

表3 硝基菲類中草藥的代謝激活實(shí)例

表4 亞甲二氧基苯類中草藥的代謝激活實(shí)例

續(xù)表

圖3 EEA的代謝激活過程

3 亞甲二氧基苯

天然產(chǎn)物中廣泛分布有亞甲二氧基苯化合物[33]。例如，體外研究報(bào)道證實(shí)紫堇靈（corynoline）[34]，五味子酯甲（schisantherin A）[35]和黃連堿（hydrastine）[36]等含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物均對(duì)P450酶表現(xiàn)出NADPH和時(shí)間依賴性的抑制作用。那可?。∟oscapine）是從罌粟科植物中分離得到的一種芐基異喹啉類生物堿，長(zhǎng)期以來在臨床上用作鎮(zhèn)咳藥[37]。該化合物含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)。已有研究表明，那可丁對(duì)CYP3A4和CYP2C9表現(xiàn)出NADPH和時(shí)間依賴性的抑制作用，這可能是臨床上發(fā)生那可丁-華法林聯(lián)合用藥所致的華法林不良反應(yīng)的重要機(jī)制[38]。黃樟油精（Safrole）是黃樟、肉桂和胡椒等植物的主要成分，其已經(jīng)被證明有肝毒性和肝致癌性的潛在風(fēng)險(xiǎn)[39]。長(zhǎng)期使用黃樟油精1年或更長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致大鼠和小鼠肝癌。黃樟油精在體內(nèi)主要由CYP2A6，CYP2C9，CYP2D6和CYP2E1等P450酶生成1'-羥基黃樟油精，然后進(jìn)一步與磺基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合形成可致癌作用的綴合物[40,41]。此外，卡瓦（Kava）是一種用于治療焦慮和失眠的草藥，醉人素（Methysticin）和二氫麻醉椒素（dihydromethysticin）是其中含有亞甲二氧基苯結(jié)構(gòu)的兩種卡瓦內(nèi)酯，可經(jīng)由P450酶介導(dǎo)的O-脫烷基化反應(yīng)形成鄰苯二酚，并進(jìn)一步氧化生成親電子的鄰醌，后者會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽，這可能是卡瓦導(dǎo)致肝毒性的潛在機(jī)制[42,43]。

4 呋喃類

越來越多的證據(jù)表明含有共同呋喃環(huán)的化合物與藥物小分子的毒性和與藥代動(dòng)力學(xué)相互作用有關(guān)。石蠶是一種具有利膽和抗菌作用的民間藥物，石蠶堿（Teucrin A）被認(rèn)為是石蠶造成肝毒性的罪魁禍?zhǔn)?，該化合物的呋喃環(huán)經(jīng)CYP3A4介導(dǎo)的氧化反應(yīng)生成反應(yīng)性環(huán)氧化物，進(jìn)而與環(huán)氧化物羥化酶形成加合物，導(dǎo)致自身抗體的形成，并誘發(fā)免疫反應(yīng)[44]。8-甲氧基補(bǔ)骨脂素可聯(lián)合長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線治療銀屑病，有研究表明8-MOP可經(jīng)由CYP2A6和CYP2B1代謝激活生成活性中間體，進(jìn)一步與GSH或大分子共價(jià)結(jié)合形成呋喃環(huán)氧化物[45,46]。檸檬苦素（Limonin），是一種從許多柑橘類水果如吳茱萸果實(shí)中提取的檸檬苦素衍生物，以NADPH-和時(shí)間依賴性方式使CYP3A4失活。推測(cè)呋喃環(huán)的生物活化形成的反應(yīng)性中間體是檸檬苦素使CYP3A4失活的主要原因[47]。薄荷呋喃（Menthofuran），一種天然存在的肝毒素，可被P450酶氧化為反應(yīng)性親電子體，這與薄荷呋喃肝臟毒性機(jī)制相關(guān)。參與這一過程的CYP亞型包括CYP1A2，CYP2E1、CYP2C19和CYP2A6[48]。薄荷呋喃也是胡薄荷酮（pulegone）的代謝產(chǎn)物，這可能也是胡薄荷酮產(chǎn)生毒性的原因之一[49]。

表5 呋喃類中草藥的代謝激活實(shí)例

表6 烯烴類中草藥的代謝激活實(shí)例

表7 蒽醌類中草藥的代謝激活實(shí)例

表8 吲哚類中草藥的代謝激活實(shí)例

此外，呋喃型化合物8-表黃藥子素E乙酸酯（EEA）是中藥黃藥子的主要組成成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠喂服EEA可引發(fā)急性肝毒性。研究者進(jìn)一步通過體內(nèi)外的代謝激活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYP3A4是EEA的主要代謝酶，催化EEA生成烯二醇活性中間體（圖3），這可能是其導(dǎo)致肝毒性的主要發(fā)生機(jī)理[50,51]。此外，活性代謝產(chǎn)物生成后，一方面可以共價(jià)修飾P450酶，人血清白蛋白等大分子蛋白，產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)免疫毒性；另一方面也可能會(huì)進(jìn)攻DNA后產(chǎn)生DNA加合物，進(jìn)而引發(fā)遺傳毒性。

5 烯烴類

烯烴是藥物中典型的毒素。草蒿素（Estragole）和甲基丁香酚（methyleugenol）存在于多種中草藥中，如肉豆蔻，肉桂，龍蒿，羅勒，茴香，茴香等。已有研究表明草蒿素具有遺傳毒性和致癌性，且與其生物轉(zhuǎn)化相關(guān)。草蒿素通過CYP1A2和CYP2A6代謝形成1'-羥基草蒿素[52]，后者進(jìn)一步發(fā)生硫酸化反應(yīng)，形成1'-磺氧基草蒿素，這是一種潛在的致癌物。失去硫酸基團(tuán)的同時(shí)，生成的草蒿素碳正離子能夠與DNA（主要是脫氧鳥苷）生成加合物[53]。與草蒿素相似，甲基丁香酚在體內(nèi)經(jīng)由CYP1A2和CYP2C9代謝生成1'-羥甲基丁烯醇，后者是一種致癌代謝物，可促進(jìn)小鼠和大鼠腫瘤的形成[54]。此外，大蒜素（Allicin）是一種從大蒜中分離出來的有機(jī)硫化合物，據(jù)報(bào)道它具有抗細(xì)菌和抗真菌作用。該化合物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二烯丙基硫醚化合物，然后通過CYP2E1將其轉(zhuǎn)化為二烯丙基砜，二烯丙基砜通過生物轉(zhuǎn)化形成活性單烯丙基環(huán)氧化物，進(jìn)一步與CYP2E1形成加合物，最終導(dǎo)致不可逆的酶抑制作用，從而滅活CYP2E1的活性[55-57]。

6 蒽醌類

何首烏是一種常用中藥材，其引發(fā)的DILI不良反應(yīng)報(bào)道逐年增多[58,59]。何首烏引發(fā)的肝損傷占全部藥物性肝損傷病例的3.24%[60]。2012年9月美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館發(fā)布的LiverTox數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄600余種具有肝毒性的西藥和中草藥，其中何首烏作為一個(gè)專題被收錄，較系統(tǒng)綜述了何首烏及其制劑肝損傷的國(guó)際報(bào)道[61]；國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心2014年7月19日第61期藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)特別報(bào)道了口服何首烏及其成方制劑存在肝損傷風(fēng)險(xiǎn)[62]。已有研究者對(duì)何首烏的部分主要單體成分進(jìn)行了體外毒性評(píng)價(jià)，其結(jié)果雖然顯示其主要成分蒽醌類化合物，如大黃素、大黃酸、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素和沒食子酸會(huì)對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷[59,63]。其中，大黃素在體內(nèi)主要經(jīng)由CYP1A2，CYP2C19和CYP3A4代謝生成氧化產(chǎn)物，大黃素及其氧化產(chǎn)物均能與谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸等生物硫醇形成加合物，這可能是其誘發(fā)肝毒性的主要機(jī)制[64]。

7 吲哚類

許多含有吲哚基團(tuán)的藥物分子被證明通過生物活化形成醌亞胺中間體。吳茱萸次堿（Rutaecarpine）和吳茱萸堿（evodiamine）是從吳茱萸中分離得到的兩種吲哚-喹唑啉類生物堿。吳茱萸次堿對(duì)CYP3A4可產(chǎn)生NADPH-和時(shí)間依賴性的抑制作用，發(fā)揮其生物活性。相反，吳茱萸堿雖然與吳茱萸次堿具有相似的結(jié)構(gòu)，但卻不能滅活CYP3A4[47]。

8 展望

綜上所述，代謝激活可作為引發(fā)中草藥毒性的重要起始事件。早期篩查和評(píng)價(jià)中藥組份的代謝激活潛能是中藥毒性評(píng)價(jià)的重要組成部分，可借助質(zhì)譜技術(shù)，采用產(chǎn)物離子掃描、中性丟失掃描等質(zhì)譜手段，結(jié)合Lightsight等先進(jìn)的質(zhì)譜解析軟件，監(jiān)測(cè)反應(yīng)性代謝物及其加合物結(jié)合物的特征質(zhì)譜信號(hào)，篩查毒性成分；進(jìn)而對(duì)其肝毒性等下游毒性事件進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)。目前，國(guó)際毒理學(xué)界提出了有害結(jié)局路徑（Adverse Outcome Pathway，AOP）這一框架，該框架是目前國(guó)際上公認(rèn)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)體系，其核心是在系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下，基于毒物作用模式（Mode of Action,MoA）[65]，將分子起始事件（Molecular Initiating Events，MIEs）至 有 害 結(jié) 局（Adverse Outcome，AO）中所有與毒性相關(guān)的關(guān)鍵事件（Key Events，KEs）的信息逐層整合并構(gòu)建在不同層面的生物體系上，如分子、亞細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、器官等水平，進(jìn)而用于毒物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與分類[66,67]。在AOP框架下，毒性評(píng)價(jià)可借助不同種類的細(xì)胞/組織/動(dòng)物等體內(nèi)外模型，并結(jié)合各種檢測(cè)和評(píng)價(jià)手段，取決于應(yīng)用目的的不同。毒性相關(guān)的分子改變、形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、功能改變等都須與起始事件及一系列中間事件，包括分子機(jī)制，可以依照特定的體系或應(yīng)用目標(biāo)邏輯性關(guān)聯(lián)起來。該框架可在評(píng)價(jià)化合物是否有害的同時(shí)對(duì)化合物進(jìn)行分類，還可依據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)以及作用模式和機(jī)制預(yù)估新化合物的毒性及潛在機(jī)制。