李秀玲，韋巖松，辛 磊，高宇星，韋詩琪，覃擁靈

(河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300)

污染土壤的重金屬主要是鎘、鎳、銅、砷、汞、鉛[1]。砷是一種有毒且致癌的化學(xué)元素，分布非常廣泛，土壤中的砷主要來源于農(nóng)業(yè)和工業(yè)[2-5]。砷在土壤中具有隱蔽性、累積性、不可逆性和長期性等特點(diǎn)[6-7]，土壤的砷污染修復(fù)十分必要。

以往對(duì)砷污染土壤的處理方法是改變耕作方式、水洗土壤或添加拮抗劑、改良劑等[6]。這些方法雖有一定作用，但存在二次污染隱患，且工程量大，耗時(shí)費(fèi)力，難以從根本上消除砷的危害[8-9]。生態(tài)修復(fù)技術(shù)克服了以上缺陷，已成為研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[10]。植物-微生物協(xié)同修復(fù)技術(shù)是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N生物修復(fù)技術(shù)[11]，可充分發(fā)揮植物與微生物的各自優(yōu)勢，取長補(bǔ)短，提高污染土壤修復(fù)效率，杜絕二次污染[12]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)砷污染的植物、微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)進(jìn)行了研究，已獲得大量研究成果[13]，但所研究的植物主要是蜈蚣草，對(duì)風(fēng)車草的研究則鮮有報(bào)道。

從長年開發(fā)的尾礦區(qū)取樣，篩選出對(duì)砷具有超富集能力的優(yōu)勢植株風(fēng)車草、蜈蚣草及砷耐受性較強(qiáng)的菌株CP3和CP7。利用篩選出來的菌株對(duì)砷富集能力最強(qiáng)的風(fēng)車草在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，考察植物、微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)對(duì)去除砷污染的效果，以期為礦區(qū)砷污染的生態(tài)修復(fù)提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

試驗(yàn)所需植株、土壤樣品均采自廣西河池某尾礦區(qū)。

試驗(yàn)所用試劑：硝酸，鹽酸，高氯酸，硫脲，抗壞血酸，硼氫化鉀，氫氧化鈉，砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，均為分析純；蛋白胨，酵母浸膏粉，瓊脂，均為生化試劑。

試驗(yàn)所用設(shè)備：原子熒光光度計(jì)(AFS-99型)，電子天平(JA2003型)，超純水機(jī)，pH計(jì)(PHS-3C型)，粉碎機(jī)，恒溫箱(DHG-9245A型)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1重金屬砷超富集植株的篩選

1)植物及其根際土壤樣品的采集。從尾礦區(qū)選取長勢良好的草本植物，連根帶土一并挖起，共13種：鬼針草(Bidens pilosa L.)，南艾蒿(Artemisia verlotorum Lamotte)，藜(Chenopodium album L.)，苦荬菜(Ixeris sonchifolia Hance)，藿香薊(Ageratum conyzoides L.)，木芙蓉(Hibiscus mutabilis Linn)，磚子苗(Mariscus sumatrensis)，大葉醉魚草(Buddleja davidii Franch.)，蜈蚣草(Eremochloa ciliaris(Linn.) Merr.)，苧麻(Boehmeria nivea(L.) Gaudich.)，風(fēng)車草(Cyperus alternifolius L.subsp.flabelliformis(Rottb.)KüKenth.)，燈芯草(Juncus effusus L.)，飄拂草屬(Fimbristylis Vahl)，每種植物選取株高相近的3株作為平行樣。取相應(yīng)植物根際的土壤作為土壤樣品。

2)土壤及植物樣品的預(yù)處理。將土壤樣品于陰涼干燥處風(fēng)干，挑去其中的石子，放入研缽中磨碎，過0.15 mm篩。將過篩后的樣品放入50 ℃烘箱中烘干一段時(shí)間后取出，放入干燥器中備用。

將植物樣品清洗干凈，晾干，測量其株高和質(zhì)量(鮮)；然后放進(jìn)50 ℃烘箱中，累積烘干48 h，再分別測定植株根部和地上部分質(zhì)量(干)。對(duì)植株的根部和地上部分分別破碎，分開標(biāo)記、保存，備用。

3)土壤pH的測定。稱取通過1.00 mm尼龍篩的風(fēng)干研磨后的土壤樣品10 g放入50 mL燒杯中，加入去離子水25 mL，攪拌靜置30 min后，用pH計(jì)測定土壤pH。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

4)土壤及植物樣品的消解。稱取一定質(zhì)量樣品加入聚四氟乙烯消解管中，加少量水潤濕，加16 mL硝酸、4 mL高氯酸，蓋上蓋子，搖勻，放置24 h后置于消解儀中加熱1 h，去掉蓋子繼續(xù)加熱。如試樣體積減小，或試樣發(fā)黑，則補(bǔ)加2 mL硝酸繼續(xù)加熱。溫度控制在200 ℃以下(超過200 ℃樣品會(huì)有損失)，直至管內(nèi)殘余灰白色殘?jiān)?，取下冷卻，用1 mL 50%硝酸溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移到50 mL比色管中，用超純水清洗，最后用超純水定容。

5)土壤與植物樣品中砷的測定。采用原子熒光光度法[14]測定土壤及植物樣品中砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測定條件：負(fù)高壓300 V；總燈電流50 mA，主輔陰極各25 mA；原子化器高度8 mm；載氣300 mL/min，屏蔽氣900 mL/min。加入還原劑砷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液后靜置30 min左右，保證砷在反應(yīng)前已被還原成正三價(jià)。

6)植物體內(nèi)砷遷移率和富集率計(jì)算。

1.2.2砷富集微生物的篩選

1)初篩。取砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的植物根際土壤作為篩選微生物土壤樣品。從該土壤樣品中分離的微生物對(duì)砷的耐受性較好。

取10 g土壤樣品加入到含有玻璃珠的90 mL無菌水中，漩渦振蕩器振蕩搖勻，再分別取1 mL加入到無菌水中，依次稀釋成質(zhì)量濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL土壤懸濁液。取質(zhì)量濃度為10-6、10-7、10-8g/mL的土壤懸濁液各200 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)3次重復(fù)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后挑取外形明顯不同的單菌落劃線培養(yǎng)，備用。

2)復(fù)篩。將初篩得到的細(xì)菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，用滅菌后的離心管在10 000 r/min速度下離心后，倒掉上清液，控干水分，菌體備用。

配制砷質(zhì)量濃度為5 mg/L的LB液體培養(yǎng)基，每瓶裝液體積100 mL，滅菌后，在超凈臺(tái)中稱取菌體1 g加入到培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株重復(fù)3次，以不加菌體的含砷LB培養(yǎng)基作為對(duì)照，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，在10 000 r/min速度下離心，利用原子熒光光度法測定上清液中砷質(zhì)量濃度。

1.2.3植物、微生物協(xié)同修復(fù)砷的效果

1)砷富集微生物的培養(yǎng)。將復(fù)篩得到的砷富集菌株CP3、CP7接種到含100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，之后用LB液體培養(yǎng)基分別將單菌株及2個(gè)菌株混合液調(diào)整至含菌量相等，備用。

2)溫室盆栽試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)在溫室大棚中進(jìn)行。供試風(fēng)車草購自河池當(dāng)?shù)鼗ɑ苁袌?，植株長勢一致。供試土壤采自未遭受重金屬污染的公園，經(jīng)風(fēng)干破碎過3 mm篩，混勻后按每盆1 kg土加入到12個(gè)花盆(上口直徑15 cm，下口直徑10 cm，高10 cm)中，每盆各種植1株風(fēng)車草，加入50 mL配好的營養(yǎng)液，緩苗7 d，之后向每個(gè)花盆中加入一定體積砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度 1 mg/mL)，使盆栽土砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/kg，然后加水保持濕潤(加水量保持在田間持水量的60%)，平衡7 d。將調(diào)整好的CP3、CP7及二者混合菌液各20 mL加入到風(fēng)車草根部，每組重復(fù)3次，以不加菌的風(fēng)車草為對(duì)照，記為ACK。每2 d澆水1次，保持含水量，10 d后加1次營養(yǎng)液。

60 d后，將風(fēng)車草整株取下，洗凈，用5 mmol/L硝酸鈣溶液浸泡根部15 min,之后用去離子水洗凈，殺青、烘干，測定風(fēng)車草的生物量、株高及砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。選用最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較的方差分析(α=0.05)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 尾礦區(qū)優(yōu)勢植物生物量及根際土壤pH的測定

尾礦區(qū)13種優(yōu)勢植物樣品生物量及根際土壤pH的測定結(jié)果見表1。

表1 13種優(yōu)勢植物樣品生物量及根際土壤pH測定結(jié)果

由表1看出：尾礦區(qū)分布的各種優(yōu)勢植物的長勢區(qū)別較明顯;其中，藿香薊、木芙蓉、蜈蚣草3種植物質(zhì)量(鮮)均低于20 g，說明這3種植物的生物量相對(duì)較低，但并不能說明它們對(duì)砷的富集效果一定低于其他植物，還需進(jìn)一步驗(yàn)證；尾礦區(qū)13種優(yōu)勢植株的根際土壤幾乎都呈弱酸性，會(huì)使土壤中的重金屬離子處于活性狀態(tài)，很容易被植物體吸收和轉(zhuǎn)化。這對(duì)研究植物對(duì)重金屬的富集效果非常有利。

2.2 尾礦區(qū)優(yōu)勢植株及其根際土壤砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

尾礦區(qū)優(yōu)勢植株及其根際土壤砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表2。

表2 尾礦區(qū)優(yōu)勢植株及其根際土壤砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表2看出:尾礦區(qū)13種植物及其根際土壤的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別較大;鬼針草、藜、苦荬菜、蜈蚣草、風(fēng)車草、燈芯草6種植物的地上部分的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于其對(duì)應(yīng)地下部分根系中的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說明這6種植物對(duì)砷有一定遷移轉(zhuǎn)化能力，能將砷從土壤中轉(zhuǎn)移至植物地上部分，通過收割植物方式可以將砷從土壤中分離去除。

2.3 植物對(duì)砷的遷移率和富集率

植物、微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤是今后重金屬修復(fù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[15]。微生物在結(jié)合重金屬的同時(shí)還產(chǎn)生一些有機(jī)酸、生長素等物質(zhì)，可促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收、累積及植物生長[16]。13種優(yōu)勢植物樣品對(duì)砷的遷移率和富集率計(jì)算結(jié)果如圖1所示。

圖1 植物樣品對(duì)砷的遷移率和富集率

由圖1看出：具有較高遷移率、富集率的只有蜈蚣草和風(fēng)車草；風(fēng)車草的遷移率和富集率均優(yōu)于蜈蚣草，富集率高達(dá)589%，遷移率高達(dá)67%。蜈蚣草對(duì)砷的吸附效果已有研究[17-18]。風(fēng)車草適應(yīng)性強(qiáng)，生長旺盛且株形較大，雖在水土保持方面有較好的應(yīng)用[19]，但對(duì)砷的吸附研究尚未見有報(bào)道：因此，選擇風(fēng)車草進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

2.4 砷富集微生物初篩

經(jīng)過初篩，共得到外形明顯不同的細(xì)菌10株，分別標(biāo)記為CP1～CP10。不加菌體的含砷LB培養(yǎng)基為對(duì)照，記為CK。將這10株菌株挑取單菌落，純化培養(yǎng)，為下一步試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

2.5 砷富集微生物復(fù)篩

上清液中的砷質(zhì)量濃度測定結(jié)果見表3?？梢钥闯觯?0株菌株對(duì)砷均具有一定富集能力，其中，CP3和CP7菌株對(duì)砷的富集能力更強(qiáng)。這是因?yàn)椋涸谝后w中，菌體表面含有多種極性官能團(tuán)，可以提供吸附活性位點(diǎn)，這些活性位點(diǎn)與砷離子結(jié)合[20]；而且，死菌也可以通過細(xì)胞壁表面的一些化學(xué)基團(tuán)吸附重金屬[21]。微生物對(duì)砷除具有富集作用之外還具有轉(zhuǎn)化功能，利用本身的氧化還原能力和甲基化作用可將砷轉(zhuǎn)化為低毒形態(tài)，以此促進(jìn)植物對(duì)砷的吸收[22]，因此，選取這2株菌進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，并通過植物-微生物的協(xié)同作用考察對(duì)砷的富集效果。

表3 上清液中的砷質(zhì)量濃度測定結(jié)果

注：數(shù)據(jù)中的不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)。

2.6 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1風(fēng)車草的生物量

風(fēng)車草試驗(yàn)前后的生物量測定結(jié)果見表4?？梢钥闯觯航?jīng)過培養(yǎng)，風(fēng)車草的株高和質(zhì)量(鮮)均有所增加，表明風(fēng)車草在設(shè)定的培養(yǎng)環(huán)境中能夠生長；添加菌株的試驗(yàn)組株高和質(zhì)量(鮮)均高于對(duì)照組，添加復(fù)合菌的試驗(yàn)組株高和質(zhì)量(鮮)分別比對(duì)照組的高57.80%和46.51%，表明添加菌株尤其是復(fù)合菌株有助于風(fēng)車草生長。微生物的代謝活動(dòng)在一定程度上可改善土壤理化性質(zhì)，產(chǎn)生一些生長素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長。

表4 風(fēng)車草試驗(yàn)前后的生物量測定結(jié)果

2.6.2風(fēng)車草中的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)

風(fēng)車草中的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及遷移率、富集率測定結(jié)果見表5?？梢钥闯?，經(jīng)過一段時(shí)間生長，土壤中所加入的砷一部分被風(fēng)車草吸收，加入菌的試驗(yàn)組砷遷移率提高21.08%，富集率提高64.87%，表明加入菌株更有利于風(fēng)車草對(duì)砷的遷移和富集。微生物的代謝活動(dòng)在一定程度上可改善土壤的理化性質(zhì)，促進(jìn)植物對(duì)土壤中重金屬的吸收和累積，提高土壤修復(fù)效率。

表5 風(fēng)車草中的砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及砷遷移率、富集率測定結(jié)果

注：同一列數(shù)據(jù)中的不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，礦區(qū)周邊長勢良好的風(fēng)車草加復(fù)合菌對(duì)砷的富集和遷移有較好效果，可以有效降低土壤中砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合菌，植物長勢良好，未出現(xiàn)重金屬毒害現(xiàn)象，其對(duì)砷的富集率和遷移率明顯提高，這證實(shí)復(fù)合菌有助于風(fēng)車草對(duì)砷的富集和遷移。在對(duì)砷的分離去除過程中，微生物和植物可共同發(fā)揮作用。