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(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

木醋液是利用樹(shù)木殘枝枯葉、木屑，經(jīng)熱解炭化、冷凝回收分離而制成的液體[1]。研究發(fā)現(xiàn)，木醋液除了在促進(jìn)植物生長(zhǎng)及畜牧業(yè)、林業(yè)等方面有應(yīng)用之外，還對(duì)細(xì)菌、真菌有抑制作用，并且具有廣譜殺菌活性[2]。尉芹等[3]發(fā)現(xiàn)，核桃殼木醋液對(duì)大腸桿菌、變形桿菌等細(xì)菌和黑曲霉、青霉等霉菌具有抑制作用。毛巧芝等[4]發(fā)現(xiàn)，苦杏殼木醋液對(duì)產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌和黃瓜炭疽病菌、棉花黃萎病菌、辣椒疫霉病菌等植物病原菌均具有一定的抑制作用，但抑制機(jī)制尚不清楚。

玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，暴發(fā)時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前防治玉米大斑病的方法主要是抗病育種和化學(xué)防治?？共∮N耗時(shí)、費(fèi)力，且抗病品種具有一定使用期限[6]，而利用農(nóng)藥進(jìn)行化學(xué)防治還會(huì)有殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題。利用木醋液抑菌作用進(jìn)行病害防治，不僅成本低廉，而且無(wú)殘留、無(wú)污染。為此，研究木醋液對(duì)玉米大斑病菌的抑制作用，分析其抑制機(jī)制，為玉米大斑病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

木醋液原液由唐山新雅諾生物科技有限公司生產(chǎn)，密度為1.009 8 g/mL。

玉米大斑病菌11-07D菌株，由唐山師范學(xué)院分子植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

配制木醋液含量分別為0(對(duì)照)、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的PDA平板培養(yǎng)基，其中木醋液的質(zhì)量濃度分別為0.00、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL，接種在PDA平板培養(yǎng)基中已活化6～7 d的玉米大斑病菌11-07D菌株的菌盤(pán)(直徑8.0 mm)。每個(gè)處理4個(gè)PDA平板，試驗(yàn)重復(fù)3次。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待第7天對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至平板約2/3處時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，參照史冠昭等[7]的方法計(jì)算抑制率，抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌盤(pán)直徑)×100%。

1.3 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響試驗(yàn)

配制木醋液質(zhì)量濃度分別為0.00(對(duì)照)、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL的PDA平板培養(yǎng)基并接種玉米大斑病菌，待對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿平板后，按十字交叉法取各試驗(yàn)處理的菌落內(nèi)4個(gè)部位的菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲分枝數(shù)目、細(xì)胞壁顏色深淺、內(nèi)含物以及細(xì)胞大小等菌絲形態(tài)的變化。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 木醋液對(duì)玉米大斑病菌生物量的影響試驗(yàn)

配制木醋液質(zhì)量濃度分別為0.00(對(duì)照)、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL的PD液體培養(yǎng)基100 mL，接種3個(gè)直徑為8.0 mm的菌盤(pán)，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，過(guò)濾去除培養(yǎng)基，壓干菌絲后測(cè)定菌絲生物量。每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算抑制率，抑制率=(對(duì)照菌絲生物量-處理菌絲生物量)/對(duì)照菌絲生物量×100%。

1.5 木醋液對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)孢量的影響試驗(yàn)

配制木醋液質(zhì)量濃度分別為0.00(對(duì)照)、5.05、10.10、15.15、20.20 mg/mL的PDA平板培養(yǎng)基并接種玉米大斑病菌，待菌絲長(zhǎng)滿平板后，滴加10 mL滅菌水，用毛筆快速刷菌絲，將孢子洗下，用2層紗布過(guò)濾，制成孢子懸浮液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)量分生孢子的數(shù)量[8]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 木醋液對(duì)玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

配制濃度為1.6×105個(gè)/mL的11-07D菌株分生孢子懸浮液，離心，去上清，加入200 μL質(zhì)量濃度分別為5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL 的木醋液，以加入無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理12 h后采用懸滴法觀測(cè)分生孢子萌發(fā)率[9]，計(jì)算分生孢子萌發(fā)抑制率，抑制率=(對(duì)照分生孢子萌發(fā)率-處理分生孢子萌發(fā)率)/對(duì)照分生孢子萌發(fā)率×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS.18軟件(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析，利用GraphPad Prism軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

測(cè)定不同濃度木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著木醋液質(zhì)量濃度增大，菌絲生長(zhǎng)速度明顯變慢(圖1)。當(dāng)木醋液質(zhì)量濃度為5.05 mg/mL時(shí)，菌絲生長(zhǎng)已受到顯著抑制(P<0.05)(圖2)，當(dāng)木醋液質(zhì)量濃度達(dá)到25.25 mg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)100%，菌絲表現(xiàn)為無(wú)生長(zhǎng)。

2.2 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響

在正常生長(zhǎng)情況下，菌株11-07D菌絲為規(guī)則條狀，細(xì)胞呈長(zhǎng)圓柱狀。在接種后第9天觀察菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)，木醋液質(zhì)量濃度為5.05、10.10 mg/mL處理組與對(duì)照組菌絲無(wú)明顯差別，質(zhì)量濃度高于15.15 mg/mL時(shí)菌絲分枝數(shù)逐漸增加，質(zhì)量濃度為20.20 mg/mL時(shí)，部分菌絲內(nèi)含物出現(xiàn)空洞。在接種后第18 天觀察菌絲形態(tài)，5.05 mg/mL木醋液處理組與對(duì)照組的菌絲形態(tài)沒(méi)有明顯差別，隨著木醋液質(zhì)量濃度的增加，菌絲細(xì)胞的內(nèi)容物逐漸減少，空洞增多，少數(shù)菌絲出現(xiàn)畸形，細(xì)胞壁顏色加深，但菌絲細(xì)胞大小無(wú)明顯差異(圖3)。

A—F：木醋液質(zhì)量濃度分別為0.00、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25 mg/mL A—F: The mass concentration of wood vinegar was 0.00, 5.05, 10.10, 15.15, 20.20 and 25.25 mg/mL, respectively圖1 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effects of wood vinegar on the hypha growth of Setosphaeria turcica

相同小寫(xiě)字母表示在0.05水平下差異不顯著，不同小寫(xiě)字母 表示在0.05水平下差異顯著，下同

The same lowercase letters in the figure indicate no significant difference at 0.05 level, and Different lowercase letters represent significant differences at 0.05 level. The same below

圖2木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌落直徑的影響
Fig.2TheeffectsofwoodvinegaronthecolonydiameterofSetosphaeriaturcica

A—E：木醋液質(zhì)量濃度分別為0.00、5.05、10.10、15.15、 20.20 mg/mL A—E: The mass concentration of wood vinegar was 0.00, 5.05, 10.10, 15.15,20.20 mg/mL,respectively圖3 木醋液對(duì)玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.3 The effects of wood vinegar on the hypha morphology of Setosphaeria turcica

2.3 木醋液對(duì)玉米大斑病菌液體培養(yǎng)生物量的影響

利用液體振蕩培養(yǎng)，接種后第4天測(cè)定生物量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5.05 mg/mL木醋液處理對(duì)玉米大斑病菌液體培養(yǎng)生物量的抑制率為12.81%，當(dāng)木醋液質(zhì)量濃度增加到10.10 mg/mL時(shí)對(duì)生物量的抑制率迅速增加到68.34%，兩者之間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖4)。而當(dāng)PDA平板中木醋液質(zhì)量濃度為10.10 mg/mL時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率僅為38.27%，與液體生物量抑制率相比減少了30.07個(gè)百分點(diǎn)，表明液體培養(yǎng)時(shí)病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)木醋液質(zhì)量濃度更敏感。當(dāng)木醋液質(zhì)量濃度超過(guò)15.15 mg/mL時(shí)，其對(duì)液體培養(yǎng)生物量的抑制率達(dá)93%以上，表現(xiàn)為幾乎無(wú)菌絲生長(zhǎng)。

圖4 木醋液對(duì)玉米大斑病菌生物量的抑制作用Fig.4 The inhibition of wood vinegar on the hypha biomass of Setosphaeria turcica

2.4 木醋液對(duì)玉米大斑病菌分生孢子數(shù)量的影響

當(dāng)對(duì)照組和處理組菌絲長(zhǎng)滿平板后，分析不同質(zhì)量濃度木醋液對(duì)玉米大斑病菌分生孢子數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組與對(duì)照組的孢子數(shù)量沒(méi)有顯著差別(P<0.05)(圖5)，說(shuō)明木醋液不影響玉米大斑病菌分生孢子數(shù)量。

圖5 木醋液對(duì)玉米大斑病菌分生孢子數(shù)量的影響Fig.5 The effects of wood vinegar on the conidial quantity of Setosphaeria turcica

2.5 木醋液對(duì)玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)的影響

在木醋液處理12 h后，測(cè)定分生孢子的萌發(fā)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5.05 mg/mL木醋液處理后分生孢子萌發(fā)率由對(duì)照組的66.0%下降到43.7%，兩者之間差異顯著(P<0.05)(圖6)。木醋液質(zhì)量濃度超過(guò)10.10 mg/mL后，分生孢子的萌發(fā)率迅速下降，木醋液質(zhì)量濃度為25.25 mg/mL時(shí)對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)90.4%。因此，木醋液對(duì)玉米大斑病菌孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用。

圖6 木醋液對(duì)玉米大斑病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.6 The effects of wood vinegar on the conidial germination of Setosphaeria turcica

3 結(jié)論與討論

木醋液是干餾熱解農(nóng)林廢棄物時(shí)產(chǎn)生的氣體，經(jīng)冷凝分離后得到的紅褐色液體，含有酸類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)等200多種成分，是一種天然無(wú)公害的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料[1]，不僅可以作為土壤改良劑用于降低土壤含鹽量[10-11]，還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[12]，能夠同時(shí)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[13-14]。木醋液對(duì)細(xì)菌和真菌都有一定的抑制作用，其中起抑制作用的主要成分是酸類(lèi)和酚類(lèi)化合物[15-16]。有關(guān)木醋液對(duì)植物病原真菌抑制作用的研究較少，李燕等[17]發(fā)現(xiàn)0.8%的木醋液能夠抑制禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)，馬駿等[18]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌在3%的木醋液黑麥培養(yǎng)基中停止生長(zhǎng)，薛桂新等[19]發(fā)現(xiàn)100 mg/mL木醋液處理可完全抑制桃黑根霉的菌絲生長(zhǎng)。以上研究?jī)H分析了木醋液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，沒(méi)有探討其對(duì)菌絲形態(tài)和分生孢子萌發(fā)的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5.05 mg/mL(0.5%)木醋液處理時(shí)，玉米大斑病菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)已受到顯著抑制；15.15 mg/mL(1.5%)以上木醋液處理菌絲細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，內(nèi)含物減少，空洞增加，液體培養(yǎng)的菌絲生物量下降93%以上；25.25 mg/mL(2.5%)木醋液處理后，玉米大斑病菌完全停止生長(zhǎng)，分生孢子萌發(fā)抑制率達(dá)90.4%。鑒于木醋液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)和辣椒病毒病都有較好的防治效果[20-21]，把木醋液開(kāi)發(fā)成為一種天然抑菌劑用于防治玉米大斑病，也將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。