嚴(yán) 松，林 顥

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

糧食在儲(chǔ)運(yùn)過程中，極易感染霉菌，導(dǎo)致發(fā)霉變質(zhì)[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界每年大概有5%～7%的谷物、飼料等農(nóng)作物受霉菌污染導(dǎo)致不能食用，不僅造成糧食的浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)的損失，還會(huì)產(chǎn)生危害人畜健康的真菌毒素等[2]。因此，監(jiān)控和預(yù)防糧食發(fā)生霉變已經(jīng)成為糧食工作中的重中之重。目前，在日常生活中對(duì)糧食霉變的判別主要是依靠人的嗅覺、視覺感官等手段完成[3]，而在實(shí)驗(yàn)室中大多采用理化方法判別糧食是否霉變[4]，主要方法有菌落計(jì)數(shù)法[5]、薄層色譜分析法[6]、高效液相色譜法[7-9]等。這些分析方法操作十分繁瑣、成本高、分析難度較大、耗時(shí)較長，往往在檢測出霉菌后，糧食已經(jīng)遭受了不可逆的危害，從而對(duì)霉變的檢測失去意義。

小麥霉變檢測技術(shù)要求和發(fā)展趨勢是快速、準(zhǔn)確、無損和早期檢測，從全新角度尋找一種普便適用、精準(zhǔn)和無損檢測方法，實(shí)現(xiàn)早期危害的真菌多參量測量，科學(xué)指導(dǎo)防霉減損，已經(jīng)成為一項(xiàng)迫切且重要的工作，這對(duì)于國家儲(chǔ)備糧的安全也具有非常重要的意義。小麥在霉變過程中，有機(jī)物受到微生物的作用后，會(huì)產(chǎn)生大量的特征性揮發(fā)性物質(zhì)[10]。目前，最常用的檢測方法就是傳感器法，對(duì)于霉變小麥的無損檢測方法主要有電子鼻技術(shù)和圖像處理技術(shù)，電子鼻技術(shù)采用的金屬氧化物傳感器對(duì)揮發(fā)性氣體的選擇性較差，靈敏度較低，而圖像處理技術(shù)只能檢測出已經(jīng)表面長霉的小麥，這兩種技術(shù)都只能用于檢測霉變較為嚴(yán)重的小麥。近年來，基于氣敏傳感器陣列的嗅覺可視化技術(shù)迅速發(fā)展，它采用的色敏材料具有廣譜性、專一性強(qiáng)、靈敏度高且不受濕度影響的特點(diǎn)[11-12]，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)小麥霉變的快速、準(zhǔn)確檢測。國內(nèi)外學(xué)者還陸續(xù)利用嗅覺可視化技術(shù)完成了對(duì)魚肉[13]、雞肉[14]、香腸[15]等新鮮度的檢測。此外，該技術(shù)還可以用于食醋[16]、水果[17]、咖啡[18]和茶葉[19-20]等食品的揮發(fā)性氣體，展現(xiàn)了嗅覺可視化技術(shù)在食品檢測方面巨大的潛力。

本研究首先利用氣相色譜-質(zhì)譜（g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同霉變程度小麥的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，找出表征小麥霉變的標(biāo)志物，并為小麥揮發(fā)性氣體的可視化檢測提供一定的參考。利用嗅覺可視化技術(shù)對(duì)霉變小麥進(jìn)行判別，借助主成分分析（principal component analysis，PCA）和模式識(shí)別法分別建立小麥霉變程度的檢測模型，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)霉變小麥快速、無損檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矮抗58小麥種子購于宿遷中江種業(yè)有限公司，將新鮮的小麥種子放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為30 ℃，相對(duì)濕度為90%，2～3 d后小麥就會(huì)逐漸發(fā)霉，通過改變小麥在生化培養(yǎng)箱中的儲(chǔ)藏時(shí)間制備不同霉變程度的小麥樣品。

8-（4-硝基苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-（4-溴苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-苯基-4,4-二氟硼二吡咯甲烷由本實(shí)驗(yàn)室自主合成；二氯甲烷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取進(jìn)樣器、75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；帶硅橡膠墊的15 mL樣品瓶上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；PVDF膜 美國密理博公司；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PC-420型磁力恒溫?cái)嚢杵?美國Coming公司；HP6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；嗅覺可視化檢測系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室自主搭建。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS對(duì)小麥霉變標(biāo)志物的篩選分析

采用頂空固相微萃取與GC-MS分別對(duì)新鮮小麥及在生化培養(yǎng)箱中儲(chǔ)藏3、7、11 d的霉變小麥進(jìn)行檢測，每個(gè)批次10 個(gè)樣品，共40 個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)開始前，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口于300 ℃老化1 h，直至無雜峰。然后稱?。?.0±0.1）g的小麥樣品置于15 mL的萃取瓶中，并加入10 μL 0.012 12 g/mL的4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)以定量。將該萃取瓶置于75 ℃進(jìn)行水浴加熱。將萃取頭刺穿瓶蓋的橡膠墊置樣品頂空，推出纖維頭并頂空吸附小麥自然揮發(fā)氣體40 min。吸附完成后，將纖維頭撤回，并將萃取頭從萃取瓶子中拔出。再將萃取頭插入GC儀器的進(jìn)樣口，推出纖維頭，250 ℃解吸5 min，完成樣品的進(jìn)樣。

G C條件：D B 5 2 M 5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫：始溫65 ℃保持4 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃后保持5 min，最后以20 ℃/min升溫至220 ℃后保持5 min；載氣（高純He）流量1 mL/min，不進(jìn)行分流；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS條件：接口溫度250 ℃；電離方式正離子，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～550 u。

1.3.2 嗅覺可視化系統(tǒng)對(duì)霉變小麥的識(shí)別1.3.2.1 色敏傳感器的制作

傳感器的制作：分別精確稱取10 mg的色敏材料，各自用二氯甲烷溶解，定容至5 mL容量瓶中。所有溶液均超聲15 min促進(jìn)溶解，獲得質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液。用100 mm×0.3 mm的毛細(xì)管吸取1 μL溶液并用陣列模板輔助點(diǎn)樣于疏水的PVDF膜上。待色敏材料在基底材料上揮發(fā)至穩(wěn)定，就獲得可視化傳感器陣列，將其用樣本袋單個(gè)密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)中采用自制的嗅覺可視化系統(tǒng)，如圖1所示，該系統(tǒng)主要由硬件和軟件兩部分組成。硬件部分主要包括反應(yīng)室、3CCD相機(jī)、漫反射LED積分球光源以及信號(hào)輸出系統(tǒng)（計(jì)算機(jī)）。軟件部分主要包括圖像獲取裝置驅(qū)動(dòng)程序和圖像處理程序[21]。

將不同的色敏材料制成傳感器構(gòu)成色敏傳感器陣列，這些色敏材料與待測物反應(yīng)后，其顏色會(huì)產(chǎn)生顯著的變化[22]。將3CCD相機(jī)獲取反應(yīng)前后的圖像經(jīng)過中值濾波、閾值二值化、形態(tài)學(xué)處理后，以傳感器陣列上每個(gè)傳感器單位的中心為圓心，分別取半徑為15 個(gè)像素點(diǎn)的圓作為每個(gè)傳感器的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），分別提取反應(yīng)前后每個(gè)傳感器中ROI的R、G、B分量的灰度均值，然后對(duì)灰度均值進(jìn)行相減，便可得到反應(yīng)前后R、G、B分量的特征差值（ΔR、ΔG、ΔB），隨后對(duì)ΔR、ΔG、ΔB的絕對(duì)值歸一化后進(jìn)行灰度圖像疊加，即可生成其特征圖。

圖1 嗅覺可視化檢測裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram showing the artificial olfaction system

1.3.2.3 霉變小麥揮發(fā)性氣體與傳感器反應(yīng)分析

利用GC-MS篩選出的小麥霉變標(biāo)志物對(duì)色敏材料進(jìn)行篩選，將篩選出的色敏材料制備成色敏傳感器陣列，并將其用于對(duì)不同霉變程度小麥（新鮮小麥、儲(chǔ)藏3、7、11 d的霉變小麥）的可視化檢測。實(shí)驗(yàn)步驟：將傳感器制備好后，立即用嗅覺可視化裝置采集原始圖像，然后分別取8.0 g不同霉變程度的小麥（新鮮小麥、儲(chǔ)藏3、7、11 d的霉變小麥）倒入小燒杯并密封，隨后置于55 ℃的烘箱內(nèi)使得傳感器與霉變小麥揮發(fā)特征氣體反應(yīng)20 min，隨后取出傳感器并用嗅覺可視化系統(tǒng)采集反應(yīng)后的圖像。最后利用圖像處理提取反應(yīng)前后的ΔR、ΔG、ΔB值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后建立對(duì)不同霉變程度小麥揮發(fā)性成分的判別模型。

1.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

GC-MS數(shù)據(jù)的收集由HP-Chemstation System工作站系統(tǒng)對(duì)照NIST 98庫完成，成分由譜庫進(jìn)行鑒定，采取面積歸一化法計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)含量。

嗅覺可視化系統(tǒng)中圖像的獲取裝置是3CCD相機(jī)，其獲取軟件是在Windows系統(tǒng)下應(yīng)用Microsoft Visual Studio+QT4.6開發(fā)完成。圖像處理部分利用Matlab軟件完成。最終將得到的特征圖譜與ΔR、ΔG、ΔB值通過PCA、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和K-最近鄰域（K-nearest neighbores，KNN）模式識(shí)別方法區(qū)分不同霉變程度的小麥。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS對(duì)霉變小麥霉變標(biāo)志物的篩選分析結(jié)果

GC-MS共檢測出53 種揮發(fā)性成分，其中烴類13 種、醇類12 種、醛類9 種、酮類4 種、雜環(huán)類3 種以及其他化合物12 種。其中，新鮮小麥的揮發(fā)性成分主要是異戊醛、己醛、壬醛3種醛類物質(zhì)；隨著小麥霉變程度的加劇，在輕微霉變小麥的揮發(fā)性氣體中開始檢測出1-辛烯-3-醇、2-丁基-1-辛醇、甲酸異戊酯等有機(jī)物，主要增加的化合物為醇類化合物。隨著霉變程度的進(jìn)一步加劇，在中度霉變的小麥中檢測出正十六烷、正十八烷和2,2,4,4-四甲基-3-戊酮，主要增加的化合物為烴類物質(zhì)以及酮類物質(zhì)。此時(shí)小麥內(nèi)部的脂肪、蛋白質(zhì)進(jìn)一步氧化、水解。在對(duì)重度霉變小麥的揮發(fā)性氣體的檢測中，檢測出反-乙-十一烯醇、反式-乙-辛烯-1-醇、苯甲醛、苯乙醛和3-辛酮，醇類物質(zhì)與醛類物質(zhì)含量大量增加。另外，在所有霉變小麥揮發(fā)性氣體的檢測中都檢測出了1-辛烯-3-醇、雙戊烯、長葉烯和右旋萜二烯。

2.1.1 小麥霉變揮發(fā)性氣體成分的PCA結(jié)果

PCA是一種通過正交線性變化實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維的多元線性分析方法[23]，利用PCA可以從大量的原始數(shù)據(jù)中提取有效信息，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為較少的綜合指標(biāo)，通過前3 個(gè)主成分的三維圖將不同類別的聚類趨勢展示出來，不僅簡化了數(shù)據(jù)量，也保留了有效信息[24-26]。由圖2可知，前3 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為46.47%、29.40%、7.92%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到83.79%，可見霉變小麥揮發(fā)性氣體成分的整體信息可用前3 個(gè)主成分表示。從圖2可以看出，儲(chǔ)藏7 d與儲(chǔ)藏11 d的小麥都在三維圖中有部分重疊并且在三維圖中相隔較近，其原因可能是小麥霉變后期揮發(fā)性氣體成分差別不大，小麥霉變情況相似。除此之外，其他批次的霉變小麥可以很好地區(qū)分。整體而言，通過對(duì)小麥揮發(fā)性氣體的PCA可良好地區(qū)分不同霉變程度小麥，進(jìn)一步證實(shí)通過對(duì)揮發(fā)性氣體的研究表征霉變小麥的可行性。

圖2 不同霉變程度小麥PCA圖Fig.2 PCA plot for wheat with different mildew degrees

2.1.2 載荷因子分析

載荷因子反映該變量在主成分中的貢獻(xiàn)度，其絕對(duì)值越大說明貢獻(xiàn)度越高。為篩選出能夠表征霉變小麥的標(biāo)志物，本研究利用載荷因子分析對(duì)PCA中的前3 個(gè)主成分分量進(jìn)行分析，如圖3所示，26號(hào)化合物的載荷因子最高，其對(duì)應(yīng)的化合物是1-辛烯-3-醇，說明1-辛烯-3-醇是小麥霉變過程中影響最大的揮發(fā)性氣體成分；其次是5號(hào)和15號(hào)，分別是異戊醛和壬醛。

圖3 不同霉變程度小麥揮發(fā)性氣體主成分模型的載荷因子Fig.3 Loading factors of volatile organic compounds in moldy wheat based on PCA model

分別對(duì)不同霉變小麥揮發(fā)性氣體中的1-辛烯-3-醇、異戊醛和壬醛含量的變化進(jìn)行方差分析，如表1所示。隨著霉變程度的加劇，1-辛烯-3-醇含量顯著增加；而異戊醛含量的變化沒有規(guī)律，差異也不顯著；壬醛也只在新鮮小麥和儲(chǔ)藏7 d的霉變小麥中檢出。因此，本研究確定以1-辛烯-3-醇作為表征不同霉變程度小麥的標(biāo)志物。

表1 方差貢獻(xiàn)率最大的3 種揮發(fā)性成分含量的變化規(guī)律Table1 Changes in the contents of 3 volatile organic components with the largest contribution to the total variance

2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)對(duì)霉變小麥的識(shí)別結(jié)果

2.2.1 嗅覺可視化對(duì)霉變小麥的反應(yīng)特征

實(shí)驗(yàn)通過嗅覺可視化系統(tǒng)從12 種氟硼吡咯類化合物和18 種金屬卟啉中篩選出3 種對(duì)1-辛烯-3-醇敏感的色敏材料，分別為8-（4-硝基苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-（4-溴苯基）-4,4-二氟硼二吡咯甲烷、8-苯基-4,4-二氟硼二吡咯甲烷。將這3 種化合物溶于二氯甲烷配制成2 mg/mL的溶液，分別用0.3 mm的點(diǎn)樣毛細(xì)管點(diǎn)在基底材料上（PVDF膜），制備成1×3的交互敏感傳感器陣列。將該陣列與不同霉變程度的小麥（新鮮小麥，儲(chǔ)藏3、7、11 d的霉變小麥）反應(yīng)，其反應(yīng)前后圖像以及特征圖像如圖4所示。

圖4 不同霉變程度小麥的傳感器響應(yīng)Fig.4 Sensor responses to wheat with different mildew degrees

2.2.2 嗅覺可視化系統(tǒng)識(shí)別的PCA結(jié)果

通過制備好的1×3的色敏傳感器陣列對(duì)不同霉變程度的小麥（新鮮小麥，儲(chǔ)藏3、7、11 d的霉變小麥）進(jìn)行分類。每個(gè)霉變程度小麥36 個(gè)樣本，共144 個(gè)霉變小麥樣本，其中每個(gè)樣本有9 個(gè)變量（3 種色敏材料×ΔR、ΔG、ΔB），其所包含的信息量過大，故采用PCA法對(duì)所提取的特征值進(jìn)行降維處理。從9 個(gè)特征參數(shù)中選取3 個(gè)主成分?jǐn)M合原數(shù)據(jù)，其方差貢獻(xiàn)率分別為55.54%、20.51%、8.98%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.03%，因此，可用前3 個(gè)主成分代表小麥霉變揮發(fā)性氣體的整體信息。從圖5可以看出，各個(gè)霉變程度的小麥在散點(diǎn)圖中都能呈現(xiàn)出一定的聚類趨勢，除了新鮮小麥與儲(chǔ)藏11 d的霉變小麥有一小部分的重疊，其他幾類的霉變小麥都能實(shí)現(xiàn)較好的區(qū)分。通過PCA結(jié)果說明，通過嗅覺可視化技術(shù)對(duì)霉變小麥進(jìn)行識(shí)別的方法可靠。

圖5 不同霉變程度小麥的PCA圖Fig.5 Principal component analysis of wheat with different mildew degrees

2.2.3 模型識(shí)別結(jié)果

2.2.3.1 KNN模型識(shí)別

KNN是一種“有監(jiān)督的學(xué)習(xí)”的模式識(shí)別方法[27]，首先將訓(xùn)練集全部樣本的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)，然后判別每個(gè)未知樣本，逐一計(jì)算其與訓(xùn)練集樣本間的距離，找出其中最近的K 個(gè)進(jìn)行判別[28]。K值的大小和主成分?jǐn)?shù)對(duì)判別結(jié)果有一定的影響。本研究以PCA提取的主成分因子作為KNN判別模型的輸入，從144 個(gè)樣本中隨機(jī)選取96 個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，剩下的48 個(gè)樣本作為預(yù)測集，采用交叉驗(yàn)證過程來優(yōu)化9 個(gè)K值（K=1,2,…,9）和9 個(gè)主成分?jǐn)?shù)（PCs=1,2,…,9），結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，當(dāng)K為2、主成分?jǐn)?shù)為9時(shí)，KNN模型交叉驗(yàn)證識(shí)別率最高。此時(shí)，模型交叉驗(yàn)證識(shí)別率為95.83%，預(yù)測集識(shí)別率為95.83%。

圖6 不同霉變程度小麥的KNN模型Fig.6 KNN model for wheat with different mildew degrees

2.2.3.2 LDA模型識(shí)別

LDA基本思想是投影，將n維數(shù)據(jù)投影到低維空間，使得投影后組與組之間盡可能地分開，即在該空間中有最佳的分離性，而衡量標(biāo)準(zhǔn)是新的子空間有最大的類內(nèi)距離和最小的類間距離[29]。以PCA提取的主成分因子作為LDA判別模型的輸入，從144 個(gè)樣本中隨機(jī)選取96 個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，剩下的48 個(gè)樣本作為預(yù)測集進(jìn)行判別分析，判別結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，模型訓(xùn)練集的識(shí)別率先上升再下降，隨后又上升到最大；而預(yù)測集的識(shí)別率先上升后持續(xù)下降。綜合考慮訓(xùn)練集和預(yù)測集的識(shí)別效果，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為5時(shí)，模型的判別效果最佳，此時(shí)訓(xùn)練集的識(shí)別率為92.71%，預(yù)測集的識(shí)別率為85.40%。

圖7 不同霉變程度小麥的LDA模型Fig.7 LDA model for wheat with different mildew degrees

綜上所述，KNN和LDA模型都實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同霉變程度小麥的判別，其模型訓(xùn)練集與預(yù)測集的識(shí)別率如表2所示。從表2可以看出，雖然LDA模型建立時(shí)所選用的主成分?jǐn)?shù)比KNN少，模型更為簡單，但是KNN的識(shí)別效果要優(yōu)于LDA。KNN模型在K為2、主成分?jǐn)?shù)為9時(shí)，模型訓(xùn)練總體識(shí)別率達(dá)到95.83%，預(yù)測總體識(shí)別率也達(dá)到了95.83%。因此，所建立的KNN模型為對(duì)不同霉變程度小麥的最佳檢測模型。

表 2 KNN與LDA模型識(shí)別率Table2 Recognition rates of KNN and LDA model

3 結(jié)論與討論

本研究利用GC-MS技術(shù)對(duì)不同霉變程度小麥的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，通過PCA將不同霉變程度小麥成功地區(qū)分，驗(yàn)證了通過基于氣敏傳感器的嗅覺可視化技術(shù)對(duì)霉變小麥檢測的可行性，并通過載荷因子分析得出1-辛烯-3-醇是能夠表征小麥霉變程度的標(biāo)志物，其含量在不同霉變程度的小麥中具有顯著差異?；诖耍眯←溍棺兊臉?biāo)志物（1-辛烯-3-醇）對(duì)色敏材料進(jìn)行篩選并制成可視化傳感器陣列。利用嗅覺可視化技術(shù)對(duì)霉變小麥進(jìn)行表征時(shí)，所建立的KNN和LDA模型都能夠完成對(duì)不同霉變程度小麥的判別，其中KNN的識(shí)別效果要優(yōu)于LDA，其模型在不同霉變程度小麥檢測的識(shí)別率達(dá)到95.83%，表明嗅覺可視化在表征小麥霉變氣體上具有優(yōu)異的檢測性能。而且相比傳統(tǒng)的GC-MS檢測，嗅覺可視化具有更高的檢測靈敏度，而且具有操作簡便快速、成本低等優(yōu)勢。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室自制的嗅覺可視化系統(tǒng)完成了對(duì)不同霉變程度小麥的檢測識(shí)別，該系統(tǒng)檢測具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性，但要將該系統(tǒng)運(yùn)用于實(shí)際應(yīng)用中，還需要提高反應(yīng)室中揮發(fā)性氣體在傳感器分布的均勻性、可視化傳感器的靈敏性和穩(wěn)定性以及進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間，提高裝置的穩(wěn)定性和精確性以用于生產(chǎn)化。