米瑞芳，陳 曦,，熊蘇玥，戚 彪，李家鵬,，喬曉玲，王守偉，張立升

（1.中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068；2.北方工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100144）

酸肉是將預(yù)處理后的原料肉切塊或切片，加入鹽、米粉等密封，自然發(fā)酵加工而成的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品。酸肉歷史悠久，主要產(chǎn)于貴州、湖南、云南、四川等地區(qū)，具有保質(zhì)期長、風味獨特、富含游離氨基酸和活性肽等特點，近年來越來越受到關(guān)注[1-4]。傳統(tǒng)酸肉多為自然發(fā)酵，自然發(fā)酵可以網(wǎng)羅多種多樣的微生物，賦予酸肉獨特風味。酸肉生產(chǎn)所采取的工藝、環(huán)境條件和地區(qū)差異可以篩選和富集不同類型和代謝特征的菌群，但受氣候、人為操作等因素影響，酸肉的品質(zhì)穩(wěn)定性難以得到保證。因此，了解酸肉中微生物群落結(jié)構(gòu)組成是調(diào)控和提升產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。

國內(nèi)對傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸肉的微生物群落研究主要還是應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離、純化以及進行一系列生理生化實驗等手段[5-8]，也有利用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳方法進行研究的報道[9]?；诤昊蚪M深度測序技術(shù)又稱為高通量測序技術(shù)，具有檢測通量高、準確度高、用時短等優(yōu)點，已越來越多地應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物生態(tài)學(xué)研究。高通量測序不需要對微生物進行分離培養(yǎng)，就可以檢測到低豐度的微生物，同時還能更加全面而準確地反映樣品的微生物群落構(gòu)成和多樣性。在發(fā)酵肉制品中，近年來有一些關(guān)于應(yīng)用高通量測序技術(shù)對發(fā)酵香腸微生物多樣性的研究報道[10-12]，然而目前尚鮮見利用該技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉的細菌群落多樣性進行研究的報道。

本研究采集云南地區(qū)4 種具有代表性工藝的傳統(tǒng)酸肉樣品，利用基于半導(dǎo)體測序技術(shù)的Ion S5 XL平臺單端測序方法，評估酸肉中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性；同時結(jié)合電子鼻和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）分析，揭示細菌群落結(jié)構(gòu)與酸肉風味品質(zhì)的關(guān)系，加深對酸肉發(fā)酵機制的認識，從而為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化改造和食品質(zhì)量安全控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種酸肉樣品，分別采集自云南當?shù)? 家不同的酸肉生產(chǎn)手工作坊。各樣品均采集3 份，于－80 ℃保存?zhèn)溆?。酸肉樣品基本信息見?。

表1 酸肉樣品基本信息Table1 Information about sour meat samples tested in this study

細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶 大連寶生物工程有限公司；C5～C20系列正構(gòu)烷烴標準溶液 美國Sigma公司；氦氣（＞99.999%） 北京氦普北方氣體工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop One超微量紫外-可見光分光光度計、Ion S5 XL測序儀、TG-Wax MS色譜毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、1310型GC-TSQ 8000型三重四極桿MS聯(lián)用儀 美國Thermo Scientific公司；Centrifuge 5417R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；T100TMThermal Cycler型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；57330-U SPME手動進樣器、50/30 μm聚二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）SPME針 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌群落的高通量測序分析

取采集的酸肉樣品各25 g，加入225 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)拍打后4 ℃搖床振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀[13]，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取微生物群落總DNA。DNA純度（A260nm/A280nm、A260nm/A230nm）及濃度采用NanoDrop One超微量紫外-可見光分光光度計測定。每種酸肉做4 個平行重復(fù)，4 種酸肉共計16 個DNA樣本送至北京諾禾致源股份有限公司，采用341F-806R為引物擴增細菌16S V3～V4區(qū)后，進行高通量測序文庫的構(gòu)建和基于Ion S5 XL平臺的單端測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后[14-15]，利用Uparse軟件以一致性97%作為標準劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），采用Silva數(shù)據(jù)庫進行比對[16]。利用QIIME軟件計算Alpha多樣性指數(shù)并繪制基于Weighted UniFrac距離的非加權(quán)組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法得到聚類樹。

1.3.2 電子鼻檢測分析

PEN3型電子鼻傳感器含有10 種金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件，每種傳感元件對應(yīng)的敏感物質(zhì)類型不同[17]。準確稱取2.0 g酸肉樣品于頂空瓶中，加蓋密封，利用PEN3型電子鼻傳感器對酸肉樣品進行檢測。測定條件：頂空溫度50 ℃；頂空時間300 s；進樣流量300 mL/min；信號采集時間90 s；傳感器清洗時間250 s。每個樣品分別做5 次平行重復(fù)。利用Winmuster軟件對電子鼻檢測結(jié)果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）并繪圖。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定分析

SPME條件：準確稱取5.0 g酸肉樣品于15 mL SPME小瓶中，置于50 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱平衡20 min，將經(jīng)老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入小瓶，50 ℃萃取30 min 后，迅速將萃取頭置于230 ℃進樣口解吸5 min[18]。

GC條件：TG-Wax MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，氦氣流速1 mL/min；進樣口溫度230 ℃。升溫程序：參照Gutsche等[19]并略作修改，起始溫度40 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至50 ℃；再以4 ℃/min升至120 ℃；最后以12 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度280 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～400 u，全掃描模式采集信號。

定性與定量分析：根據(jù)所得MS圖，檢索NIST數(shù)據(jù)庫，結(jié)合C5～C20系列正構(gòu)烷烴混標計算保留指數(shù)（retention indice，RI），對酸肉的揮發(fā)性組分進行定性分析，計算每種組分的平均含量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19軟件進行顯著性分析（P＜0.05）和Pearson相關(guān)性分析（P＜0.05），利用Sigmaplot 12.5軟件進行柱形圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酸肉中細菌群落多樣性分析

2.1.1 細菌群落的OTUs聚類分析

圖1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Fig.1 Statistics of tags annotation in sour meat samples

圖2 各樣品中細菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction analysis of pyrosequencing reads for bacteria from sour meat samples

由圖1可知，Y1、Y2、Y3和Y4樣本所獲得的細菌原始序列條數(shù)（總tags數(shù)）平均值分別為110 117、111 138、110 177 條和110 151 條，序列平均長度429 bp。如圖2所示，所有樣品的稀釋曲線都已進入平臺期，說明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTUs邊際貢獻很小。其中Y4細菌的平均OTUs值顯著高于其他3 個（P＜0.05），達到187，而Y1、Y2、Y3之間無顯著性差異，分別為146、149和145。其中4 種樣品共有的細菌種類為112 個。

2.1.2 細菌群落的豐度分析

圖3 基于加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類樹Fig.3 UPGMA cluster dendrogram of sour meat samples based on the Weighted UniFrac distance

如圖3所示，4 種酸肉樣品中主要存在11 個細菌類群，分別是厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍藻細菌、擬桿菌門、浮霉菌門、裝甲菌門、疣微菌門、酸桿菌門等。4 種酸肉所含物種基本相似，主要優(yōu)勢菌是厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。其中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度分布為Y2（98.92%）＞Y4（97.80%）＞Y3（86.85%）＞Y1（83.73%）；其次是變形菌門，分別為Y1（15.70%）＞Y3（11.30%）＞Y4（1.58%）＞Y2（0.32%）；放線菌門分別為Y3（1.67%）＞Y4（0.33%）＞Y1（0.29%）＞Y2（0.22%）。另外，通過聚類分析可知Y1和Y3距離最近，其微生物種類和數(shù)量最為相似，這可能與其工藝較為相似有關(guān)。

表2 酸肉樣品中優(yōu)勢細菌菌屬（前20）及其在各樣品中的相對豐度Table2 Abundances of predominant bacteria (top 20) in four sour meat samples%

如表2所示，進一步對細菌群落中主要優(yōu)勢菌屬（前20 位）進行分析。不同種類酸肉中細菌菌屬結(jié)構(gòu)存在一定差異。厚壁菌門中，乳桿菌屬占絕對優(yōu)勢，在所有樣品中的相對豐度為31.28%～74.27%，這與利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究酸肉微生物群落的結(jié)果較為一致，例如李宗軍等[8]在酸肉發(fā)酵過程中檢測到的優(yōu)勢細菌是乳桿菌、片球菌、明串珠菌和微球菌等；周才瓊等[20]在渝黔地區(qū)傳統(tǒng)酸肉中檢測到的優(yōu)勢細菌也是乳桿菌和片球菌；陳韻等[9]從貴州侗族發(fā)酵肉中檢測到優(yōu)勢細菌為乳桿菌和葡萄球菌。在其他發(fā)酵肉制品例如發(fā)酵香腸中，利用高通量測序研究也發(fā)現(xiàn)乳桿菌是主要優(yōu)勢細菌，例如Quijada等[10]利用高通量測序技術(shù)研究干發(fā)酵香腸中的微生物群落，其中乳桿菌屬占比為65.1%～92.0%；Fontana等[21]利用高通量測序技術(shù)研究駱駝肉發(fā)酵香腸中的乳酸菌群落，結(jié)果表明優(yōu)勢菌是乳桿菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。其次是魏斯氏菌屬，Y4和Y2樣品中相對豐度較高，分別為60.00%和17.93%，遠高于Y1和Y3。乳球菌、片球菌、葡萄球菌等也是厚壁菌門中的優(yōu)勢菌屬。變形菌門中，Y2和Y4中腸桿菌含量遠低于Y1和Y3，而且未檢出大腸埃希氏菌-志賀氏菌群（大腸埃希氏菌和志賀氏菌16S rDNA序列幾乎完全一致，進一步區(qū)分需要生化及血清分型）。這可能與某些魏斯氏菌可產(chǎn)細菌素有關(guān)[22]，從而保證酸肉的質(zhì)量安全性。放線菌門和擬桿菌門中，各樣品中大部分菌屬的相對豐度都低于0.1%。

2.2 不同種類酸肉中揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

2.2.1 酸肉樣品的整體風味分析

圖4 利用電子鼻檢測不同酸肉風味的PCA圖Fig.4 PCA plot of volatile compounds in different sour meat samples distinguished by electronic nose

如圖4所示，第1主成分和第2主成分的方差貢獻率分別為89.35%和10.50%，總貢獻率接近100%，可以代表酸肉樣品的整體信息。圖4中各組分析數(shù)據(jù)點均分布在各自的區(qū)域內(nèi)，沒有重疊現(xiàn)象，說明4 種傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉的揮發(fā)性氣味有較大差異性。其中Y1和Y3的中心距離最小，說明Y1和Y3的整體風味差異最小，這與細菌群落的分析結(jié)果相符（圖3）。

2.2.2 酸肉樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及含量分析

由表3可知，利用SPME-GC-MS技術(shù)，在4 種酸肉樣品Y1、Y2、Y3和Y4中分別檢測到52、53、37 種和73 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，共計126 種。主要包括酸類14 種、醇類28 種、醛類14 種、酯類24 種、酮類12 種、萜烯類15 種、含硫/含氮類8 種和芳香族類11 種。僅在其中1 種酸肉樣品中檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)有77 種，占總揮發(fā)性物質(zhì)種類的61.1%，包括酸類7 種、醇類18 種、醛類11 種、酯類11 種、酮類10 種、萜烯類10 種、含硫/含氮類6 種、芳香族類4 種，說明云南地區(qū)傳統(tǒng)酸肉的揮發(fā)性物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)差異較大，風味較為多樣化。余冰等[23]從侗族酸肉中檢測到48 種揮發(fā)性物質(zhì)，酯、醛、醇、烷烴和其他雜環(huán)化合物分別為13、11、6、5、13 種；周才瓊等[24]從渝黔苗漢雜居地區(qū)傳統(tǒng)酸肉中檢測到85 種揮發(fā)性物質(zhì)，酯、醛、醇、酚酸和碳氫化合物分別為23、23、9、3、27 種；張倩等[2]從貴州酸肉中檢測到34 種揮發(fā)性物質(zhì)，酸、醛、烷烴、烯、酯和醇類物質(zhì)分別為15、11、1、1、3、3 種；黃群等[25]在傳統(tǒng)湘西酸肉中檢測到酯、醛、醚、醇、烴和其他雜環(huán)化合物分別有5、3、2、9、19、5 種，共計43 種。這些研究報道進一步表明，不同地區(qū)和工藝制作的酸肉具有各自獨特的風味。

如圖5所示，可在2 種或2 種以上酸肉中檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)有49 種，其中酸類、醇類和酯類在不同酸肉樣品之間具有較大差異。例如乙酸、辛酸、癸酸在Y4樣品中的含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），張倩等[2]在貴州酸肉中也檢測到了這3 種物質(zhì)，但其檢測到的其他酸類物質(zhì)如油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸，在本實驗樣品中并未檢測到。醇類物質(zhì)中含量差異顯著的主要有乙醇、正己醇、順-3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇和苯乙醇，其中乙醇在4 個樣品中的含量都較高，樣品Y4的乙醇含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05）。乙醇、正己醇、1-辛烯-3-醇（蘑菇香、水果香）、苯乙醇（玫瑰香、甜香）均在侗族酸肉中報道過，且苯乙醇是侗族酸肉的主體風味成分之一[23]，而順-3-己烯-1-醇首次在酸肉中發(fā)現(xiàn)。酯類物質(zhì)中，不同樣品間差異顯著的包括己酸乙酯（果香、酒香）、庚酸乙酯（青香、果香）、乳酸乙酯（果香）、辛酸乙酯（花香、水果香）和癸酸乙酯（蜂蜜香、玫瑰香）等，其中己酸乙酯、乳酸乙酯在Y4樣品中含量均為最高，Y1和Y3次之。據(jù)報道，己酸乙酯和辛酸乙酯是侗族酸肉的主體風味物質(zhì)[23]，癸酸乙酯是渝黔苗漢雜居地區(qū)傳統(tǒng)酸肉的主體風味物質(zhì)[24]，這些乙酯類物質(zhì)通常能夠賦予產(chǎn)品果香味和酒香味[26]，對酸肉的風味品質(zhì)形成具有重要貢獻。

圖5 不同酸肉中各揮發(fā)性風味化合物的種類數(shù)Fig.5 Number of volatile compounds belonging to each chemical class in different sour meat samples

圖6 不同酸肉中各類揮發(fā)性風味化合物的相對含量Fig.6 Relative percentages of each class of volatile compounds in different sour meat samples

另外，本實驗中檢測到的芳樟醇、α-松油醇、茴香腦、右旋萜二烯、3-蒈烯、1-石竹烯、大根香葉烯等化合物是八角茴香和花椒的主要成分，在Y2和Y4樣品中的含量較高，可能與不同酸肉制作時采用的工藝配方有關(guān)。如圖6所示，4 種酸肉樣品中檢測到的醛類、酮類、含硫/含氮化合物的相對含量都較低，Y2和Y3中檢測到少量的二甲基三硫化物，二甲基三硫化物具有令人不愉快的味道，含量過高可能會影響產(chǎn)品風味[27]；Y4樣品中還檢測到吡嗪類含氮化合物，吡嗪類化合物主要呈現(xiàn)出豆豉、堅果風味[28]，這是首次在酸肉中檢測到該類化合物。

2.2.3 酸肉揮發(fā)性風味物質(zhì)與微生物的關(guān)系

如表3所示，4 種酸肉樣品中的主要酸類物質(zhì)均為乙酸，而優(yōu)勢微生物均為乳桿菌、魏斯氏菌等乳酸菌（表2）。乳酸菌對發(fā)酵肉制品風味的貢獻主要是通過分解代謝碳水化合物、氨基酸等產(chǎn)生有機酸[29-30]。其中Y4樣品的總酸含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），這可能是由于Y4中某些細菌（例如魏斯氏菌）具有較強的產(chǎn)酸能力[31]，大大提高了該樣品中有機酸例如乙酸、辛酸、癸酸的含量（均與其他3 個樣品差異顯著，P＜0.05），同時相關(guān)性分析表明乙酸與魏斯氏菌呈極顯著正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)0.995，P＜0.01）。

由圖5、6可知，所有酸肉樣品中醇類和酯類物質(zhì)的種類數(shù)和相對含量都較高。這可能是由于細菌對碳水化合物的代謝和脂質(zhì)氧化可產(chǎn)生并不斷積累醇類物質(zhì)，例如異型發(fā)酵的乳酸菌可產(chǎn)生乙醇，而有研究表明乳酸菌也會影響發(fā)酵香腸的脂肪氧化速率[32]。所有酸肉樣品中的酯類物質(zhì)均以乙酯類為主，乙酯類物質(zhì)占酯類物質(zhì)的85%以上，而有研究報道成熟發(fā)酵香腸中的酯類物質(zhì)也以乙酯類為主[33]。由于原料豬肉中的酯類物質(zhì)含量較低，且以甲酯類為主[34-35]，因此酸肉中酯類物質(zhì)的形成主要與發(fā)酵相關(guān)。本實驗中檢測到的乙酯類物質(zhì)主要有乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。乳桿菌在酸肉中占絕對優(yōu)勢地位，其代謝產(chǎn)物乳酸是形成乳酸乙酯及其他香味成分的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[36]；明串珠菌可利用碳水化合物進行異型發(fā)酵產(chǎn)生D型乳酸和乙酸，分別是乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體物[37]。Y4樣品中的乙醇含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），醇與酸反應(yīng)生成酯類，這可能是Y4樣品中己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、癸酸乙酯等乙酯類物質(zhì)都顯著高于其他3 個樣品的原因。另外，樣品Y1和Y3中，己酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯等均無顯著性差異，這可能是由于這2 種酸肉制作工藝較為類似，導(dǎo)致其微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似（圖3）。

續(xù)表3

續(xù)表3

3 結(jié) 論

本研究運用高通量測序技術(shù)對采集的4 種傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉的細菌群落進行檢測。結(jié)果表明傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中細菌多樣性豐富，包含11 個門，其中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，約占總細菌群落的83.73%～98.92%，其次是變形菌門和放線菌門。主要優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳球菌屬。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比，高通量測序具有檢測通量高、準確度高、用時少等優(yōu)點。同時，利用SPME-GC-MS，從酸肉樣品中檢測到酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、萜烯類等揮發(fā)性風味化合物共9 大類126 種。結(jié)果表明4 種酸肉樣品之間的菌屬種類和相對豐度均存在一定的差異性，同時酸肉樣品中的風味物質(zhì)在種類和含量上也存在較大差異性。結(jié)果表明乳桿菌、魏斯氏菌等微生物，可能影響酸肉中醇類、酯類和酸類揮發(fā)性風味物質(zhì)，從而影響酸肉的風味品質(zhì)。本研究結(jié)果為深入了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸肉的微生物群落與風味的相關(guān)性、開發(fā)酸肉專用細菌劑提供數(shù)據(jù)支撐和參考依據(jù)。