朱凱莉，陳婧超，范清蘋，惠愛玲*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

亞麻籽油含豐富的不飽和脂肪酸，其中以亞油酸和亞麻酸為主的多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acids，PUFA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)60%以上[1]。亞油酸和亞麻酸是人體必需脂肪酸，其在治療皮炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、高血壓、哮喘、過敏癥和抑制腫瘤生長方面具有一定功效[2-5]。因此，對亞麻籽油中亞油酸和亞麻酸的分離純化或富集研究尤為重要。尿素包合法（脲包法）是分離純化亞油酸、亞麻酸等PUFA的常用方法[6-7]。脲包法對設(shè)備要求簡單，且易操作，但存在包合時間長[8-10]、產(chǎn)品得率低[11-12]、單不飽和脂肪酸與PUFA選擇性差[13]等缺點。為此，一些研究者對傳統(tǒng)脲包（低溫脲包、冷凍脲包）過程加以改進(jìn)，如采用多次包合[14-15]、緩慢降溫[16]、離心[17]、溶劑結(jié)晶法和脲包法聯(lián)用[18]、脲包法與選擇性加氫結(jié)合[19]等方法提高PUFA的純度；通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗[20]、攪拌梯度冷卻結(jié)晶[21]以縮短包合時間；采用快速降溫（1 min內(nèi)將溫度從室溫降到－60 ℃）使游離脂肪酸的分離更具有選擇性[22-24]；采用超聲波處理以提高重質(zhì)油中鏈烷烴和環(huán)烷烴分離效果[25]。以上改進(jìn)措施在某種程度上提高了傳統(tǒng)脲包法的分離效率，但產(chǎn)品得率仍然偏低。

Brown等[26]研究發(fā)現(xiàn)施加一定壓力可使2,10-十一烷二酮-尿素包合物結(jié)構(gòu)發(fā)生一些不可逆的變化。高壓處理對飽和脂肪酸的影響較不飽和脂肪酸更為顯著[27]。袁野等[28]采用低溫協(xié)同超高壓脲包法分離大豆油脫臭餾出物中飽和脂肪酸乙酯工藝，當(dāng)脲包混合液在4 ℃下預(yù)冷90 min并用300 MPa超高壓處理60 min時，非包合相（濾液）中飽和脂肪酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)由15.22%減少至2.83%，不飽和脂肪酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)由37.65%提高至60.01%。以上研究結(jié)果提示，將高壓技術(shù)引入傳統(tǒng)脲包過程，有望取得與冷凍脲包法類似的分離效果，并可能大幅縮短包合周期。

本研究以模擬亞麻籽油混合脂肪酸（fatty acid mixed，MFA）為研究對象，采用超高壓脲包法富集PUFA，優(yōu)化包合工藝參數(shù)以提高PUFA的分離效率；采用差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）研究壓力對尿素包合物晶體熱力學(xué)性質(zhì)與晶體形貌的影響，初步解析超高壓處理提高PUFA分離效率的機(jī)理，為超高壓技術(shù)應(yīng)用于油脂PUFA分離提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；棕櫚酸甲酯（99.0%）、硬脂酸甲酯（98.5%）、油酸甲酯（99.0%）、亞油酸甲酯（99.4%）、亞麻酸甲酯（98.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；十七烷酸甲酯 美國Uu-chek公司；尿素、鹽酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、無水甲醇、濃硫酸、正己烷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YCB630/2.5型食品超高壓處理裝置 中國兵器工業(yè)第五二研究所；Claus 600氣相色譜儀（gas chromatography，GC） 珀金埃爾默儀器（上海）有限公司；Q200 DSC儀 美國TA公司；SU8020場發(fā)射SEM日本日立公司；X’Pert Pro MPD X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 荷蘭帕納科公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽油MFA制備

模擬亞麻籽油中MFA體系，將5 種主要脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中亞油酸、亞麻酸為PUFA）按一定比例混合均勻。GC定量檢測顯示其質(zhì)量比為7∶5∶19∶15∶54。

1.3.2 脲包法富集亞麻籽油中PUFA

低溫脲包法流程為：尿素、95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于4 ℃放置18 h→待抽濾處理。

冷凍脲包法流程為：尿素、95%乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于－18 ℃放置18 h→待抽濾處理。

超高壓脲包法流程為：尿素、95%乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于聚乙烯袋中冷卻30 min→待高壓處理。

預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)超高壓處理之前的預(yù)冷卻溫度及超高壓處理的保壓時間對PUFA分離效果影響較小，從使包合物充分結(jié)晶且經(jīng)濟(jì)實用的角度考慮，選擇高壓處理之前在20 ℃下冷卻30 min，保壓20 min。因此，本研究僅考察不同尿素/MFA質(zhì)量比及壓力大小對非包合相（濾液）中PUFA富集效果及包合相中PUFA非選擇性包合的影響。

尿素/MFA質(zhì)量比的影響：固定MFA2 g、95%乙醇溶液14 mL，尿素用量分別為1、2、3、4 g，脲包混合液在20 ℃下冷卻30 min，之后在300 MPa下保壓20 min使其結(jié)晶。

壓力大小的影響：固定MFA2 g、95%乙醇溶液14 mL、尿素3 g，脲包混合液在高壓前于20 ℃冷卻30 min，其后分別采用0.1、100、200、300、400 MPa壓力保壓20 min使其結(jié)晶。

1.3.3 包合相及非包合相中PUFA得率的測定

對脲包法得到的包合物立即進(jìn)行抽濾，分別得到包合相（晶體）及非包合相（濾液）。將包合相晶體晾干，取1 g置于10 mL具塞試管中，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)15%鹽酸溶液置于50 ℃水浴至晶體完全溶解[29]，用正己烷萃取脂肪酸，減壓濃縮得包合相脂肪酸。將非包合相中濾液減壓濃縮除去乙醇，加入正己烷萃取脂肪酸，水洗去除尿素，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得非包合相脂肪酸。將上述脂肪酸分別甲酯化后用GC定量檢測其中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并按下式計算非包合相PUFA得率（Yf）。

式中：mf表示非包合相中M F A的質(zhì)量/g；ωf表示非包合相中P U F A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；m表示原料中M F A的質(zhì)量/g；ω表示原料中PUFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

脂肪酸甲酯化：取脂肪酸200 mg，加入1 mL甲醇和0.1 mL濃硫酸，混勻后65 ℃水浴加熱1 h，加入1 mL正己烷，離心，保留上清液待用。取上清液20 μL，加入200 μL含3 mg/mL十七烷酸甲酯（內(nèi)標(biāo)物）的正己烷溶液，并用正己烷定容至0.5 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待GC檢測。

GC檢測條件：PE Elite-WAX ETR 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度300℃；空氣流速400 mL/min，氫氣流速40 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣流速1 mL/min；分流比12∶1；進(jìn)樣量0.5 μL；升溫程序：200 ℃保持10 min。

1.3.4 PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GC定量檢測

方法特異性：對加入內(nèi)標(biāo)物前后的MFA進(jìn)行GC分析，具體方法如下。以正己烷為溶劑，配制質(zhì)量濃度為3 mg/mL的十七烷酸甲酯溶液。取兩份200 mg MFA甲酯化并稀釋后的上清液，其中一份加入200 μL十七烷酸甲酯溶液，另一份加入等體積的正己烷，利用GC檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取一定質(zhì)量的棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷混合溶解，每種脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度分別為6.0、4.0、9.6、8.6、10.0 mg/mL。用正己烷稀釋成7 個質(zhì)量濃度梯度的MFA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為1.2 mg/mL，GC檢測，以每種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（y）對每種脂肪酸甲酯溶液質(zhì)量濃度（x/（mg/mL））進(jìn)行線性回歸分析，求得5 種脂肪酸甲酯在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)（R）應(yīng)大于0.99。

精密度實驗[30]：用正己烷將MFA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯質(zhì)量濃度分別為1.20、0.80、1.92、1.72、2.00 mg/mL，其中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL，用GC對其重復(fù)測定6 次，比較測定結(jié)果。

回收率實驗[31]：本研究采用加標(biāo)回收法測定回收率，取已知質(zhì)量濃度的MFA甲酯樣品，加入5 種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，使棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度相對于已知質(zhì)量濃度分別增加0.5、0.5、1.5、1.5、4.0 mg/mL，每種樣品取6 份作為平行樣，采用GC內(nèi)標(biāo)法定量檢測，通過每種標(biāo)準(zhǔn)品的加入量和檢出量評價回收率。

穩(wěn)定性實驗[32]：取處理后的MFA樣品，24 h內(nèi)每隔2 h取待測液進(jìn)行GC檢測。

1.3.5 包合相晶體分析

DSC分析：準(zhǔn)確稱取3 mg包合物晶體放入鋁制坩堝中，密閉放入樣品池中，并用空白坩堝作對照。設(shè)置程序升溫樣品初始溫度80 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至160 ℃。場發(fā)射SEM觀察：參考鉏曉艷等[33]的方法。XRD分析：參考陳迪釗等[34]的方法并略作改動，掃描范圍為7°～40°。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GC定量分析

圖1 MFA甲酯未加（A）/加（B）內(nèi)標(biāo)物的比較Fig.1 Chromatograms of MFA methyl esters without （A）/with （B）internal standard substance

圖1 A是模擬亞麻籽油中5 種主要脂肪酸的GC圖譜，圖1B是加入內(nèi)標(biāo)物十七烷酸甲酯后的圖譜。可以看出十七烷酸甲酯與被檢測脂肪酸有明顯的分離，且其保留時間處于5 種脂肪酸中間，適于作為脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)定量檢測的理想內(nèi)標(biāo)。

棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯在0.12～6.00、0.08～4.00、0.19～9.60、0.17～8.60、0.20～10.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程分別為y＝0.705 0x＋0.029 8、y＝0.774 3x＋0.020 8、y＝0.817 1x＋0.053 5、y＝0.806 5x＋0.033 1、y＝0.779 2x＋0.050 7，R在0.997 6～0.998 5之間，線性關(guān)系良好，說明該實驗方法可用于亞麻籽油中5 種脂肪酸質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確測定。精密度實驗結(jié)果得出5 種脂肪酸甲酯的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%，表明本方法可靠、準(zhǔn)確，具有重復(fù)性；回收率實驗中5 種脂肪酸定量分析的回收率在94.44%～103.28%之間，符合實驗要求，被測脂肪酸的RSD均小于3%，重復(fù)性較好；穩(wěn)定性實驗結(jié)果中5 種脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度RSD均小于4%，表明脂肪酸甲酯樣品在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2 超高壓脲包法分離富集PUFA分析

2.2.1 尿素/MFA質(zhì)量比分析

在傳統(tǒng)脲包法分離過程中，尿素/脂肪酸質(zhì)量比決定了尿素-脂肪酸包合物的形成，并最終影響飽和脂肪酸的包合效果[35]。在超高壓脲包法分離中，隨著尿素/MFA質(zhì)量比的增加，非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加。如圖2所示，當(dāng)尿素/MFA質(zhì)量比達(dá)4∶2時，非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)由MFA中的69%增加至99.16%。與此同時，包合相中也檢測到50.59%的PUFA，即大于50%的PUFA被非選擇性包合，這一結(jié)果也可從非包合相中PUFA得率僅為36.62%得以印證。而當(dāng)尿素/MFA質(zhì)量比為3∶2時，盡管非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（96.05%）與質(zhì)量比4∶2（99.16%）時相比略有降低，但非包合相中PUFA得率高達(dá)81.81%，這得益于PUFA在尿素/MFA質(zhì)量比為3∶2時被非選擇性包合的損失（37.87%）與質(zhì)量比4∶2（50.59%）時相比有所降低。綜合考慮PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及得率，選擇尿素/MFA質(zhì)量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 尿素/MFA質(zhì)量比對PUFA分離效果的影響Fig.2 Effect of urea/MFA ratio on separation eff i ciency of PUFA

2.2.2 超高壓處理壓力分析

圖3 處理壓力對PUFA分離效果的影響Fig.3 Effect of pressure on separation eff i ciency of PUFA

一般認(rèn)為：脂肪酸與尿素包合過程是一個反應(yīng)結(jié)晶（沉淀）過程，超高壓處理有助于促進(jìn)尿素-脂肪酸包合結(jié)晶過程[21]。如圖3所示，處理壓力對包合相及非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較小，然而施加壓力明顯促進(jìn)了非包合相中PUFA得率的變化。當(dāng)處理壓力小于300 MPa時，非包合相中PUFA得率隨著壓力的增大而逐步增加；而當(dāng)壓力達(dá)到400 MPa時，非包合相中PUFA得率（61.57%）較300 MPa（81.81%）時降低了24.74%（P＜0.05）。故超高壓脲包法處理壓力以300 MPa為宜。

2.3 超高壓脲包法與冷凍脲包法的對比

2.2 節(jié)結(jié)果確立了超高壓脲包法富集亞麻籽油中PUFA的較優(yōu)工藝：尿素/MFA質(zhì)量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14，20 ℃冷卻后對脲包混合液施加300 MPa壓力，保壓20 min。以此料液比為基礎(chǔ)，同時比較4 ℃低溫脲包、－18 ℃冷凍脲包對PUFA富集效果影響。由圖4可知，超高壓脲包法所得非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（96.05%）與4 ℃（95.68%）或－18 ℃（97.41%）包合18 h的效果類似，但其非包合相中PUFA得率分別提高了28.92%和41.39%，這也說明超高壓脲包法非包合相中PUFA得率的提高不止是由非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降導(dǎo)致，壓力在一定程度上促進(jìn)了非包合相中PUFA得率的提高，且使包合時間大幅縮短，超高壓脲包法大幅提高了PUFA的分離效率。

圖1 不同結(jié)晶條件對PUFA分離效果的影響Fig.1 Effect of crystallization conditions on separation eff i ciency of PUFA

圖5 不同結(jié)晶條件下的尿素包合物晶體XRD圖譜Fig.5 XRD of urea inclusion complex crystals under different crystallization conditions

由于超高壓脲包法可達(dá)到冷凍脲包法相似的分離效果，因此將二者的包合物作晶體XRD分析，結(jié)果如圖5所示。尿素包合物晶體衍射峰對應(yīng)六方晶系晶體結(jié)構(gòu)[36]。冷凍與超高壓條件下出現(xiàn)強(qiáng)烈衍射峰時所在的角度相近，由Jade軟件得出冷凍條件下晶面間距分別在7.160 7、4.149 7、3.895 8、3.585 2、3.408 6、2.704 0、2.6287 ?時有強(qiáng)烈的衍射峰，超高壓條件下晶面間距分別在7.129 4、4.118 7、3.859 5、3.554 0、3.394 8、2.693 3、2.6206 ?時有強(qiáng)烈的衍射峰。兩種條件下晶體出峰的晶面間距無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 壓力對尿素包合物晶體性質(zhì)的影響

2.4.1 DSC分析結(jié)果

為探究超高壓脲包過程中非包合相中PUFA得率隨壓力變化的原因，用DSC儀測試了不同壓力條件下尿素包合物晶體熱力學(xué)性質(zhì)。尿素包合物晶體熔化是吸熱的過程，主要分為兩個熔化階段，第1階段是尿素包合物六方晶系晶體的熔化階段，第2階段是四方晶系尿素晶體的熔化階段[36]。在有機(jī)溶劑中，尿素包合脂肪酸時會形成六棱柱框架[37]，尿素-油酸包合物晶體屬于六方晶系，其晶體熔點為117.34 ℃[36]。圖6中DSC曲線的第1個階段峰溫均接近于六方晶系晶體的熔點，故選取不同壓力條件下的DSC曲線中第1個峰進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。

圖6 不同處理壓力尿素包合物DSC曲線Fig.6 DSC curves of urea inclusion complexes at different pressures

由表1可知，高壓包合晶體樣品ΔT明顯高于未經(jīng)超高壓處理（0.1 MPa）樣品。經(jīng)過超高壓處理后，其晶體熔融溫度范圍較未經(jīng)高壓處理時更寬、峰溫更高，說明超高壓處理后晶體平均厚度較厚，且壓力從0.1 MPa上升至300 MPa時，晶體峰溫逐漸升高，說明晶體厚度隨壓力的升高而增加；400 MPa處理時峰溫降低，可能是由于壓力過大導(dǎo)致晶體六棱柱結(jié)構(gòu)在某種程度上被破壞。超高壓處理包和物晶體ΔH較未經(jīng)超高壓處理的樣品高，其中經(jīng)300 MPa超高壓處理后樣品ΔH較未經(jīng)超高壓處理樣品高36.68%，可知超高壓處理所得晶體中，其六方晶系的晶體熔融時吸熱較多，說明超高壓處理可在一定程度上促進(jìn)尿素包合物結(jié)晶生成六方晶系晶體，從而促使非包合相中PUFA得率提高。

表1 不同處理壓力尿素包合物DSC曲線分析Table1 Thermodynamic parameters from DSC curves of ureainclusion complexes at different pressures

2.4.2 SEM觀察結(jié)果

圖7 不同處理壓力尿素包合物的SEM圖Fig.7 SEM images of urea inclusion complexes at different pressures

由圖7可以看出，未經(jīng)超高壓處理時樣品的晶體形態(tài)粗細(xì)不均、長短不一，有些晶體并未形成六棱柱狀態(tài)，說明尿素并未完全包合脂肪酸，使得非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較超高壓處理時低；而且其晶體分布較為松散，這可能是由于晶體生長環(huán)境不固定，導(dǎo)致其在抽濾過程中非包合相液體易殘存于晶體中，最終使得非包合相中PUFA得率較低。當(dāng)施加100 MPa壓力時，尿素包合物晶體形態(tài)規(guī)則，呈長針柱型，能看出明顯的六棱柱晶體形貌，晶體大小分布相對0.1 MPa處理時較為均勻，說明在此條件下尿素可以相對成功地包合脂肪酸，使得非包合相中的PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增高，但晶體分布仍較為松散。當(dāng)壓力增加到300 MPa時，晶體呈短針狀柱體，尿素優(yōu)先選擇性包合結(jié)構(gòu)簡單的飽和脂肪酸，使得PUFA較難進(jìn)入尿素包合物框架，且在300 MPa處理時，晶體分布明顯比0.1、100 MPa處理時密集，在抽濾時非包合相液體不易殘存于晶體中，從而使得300 MPa處理時非包合相中PUFA得率最高。在400 MPa處理時，尿素包合物晶體呈六棱柱型，但可以看出有較多是斷裂后短小的六棱柱晶體，這可能是由于壓力過高導(dǎo)致包合條件較劇烈，從而使已經(jīng)結(jié)合的尿素分子能量過高，當(dāng)尿素晶體達(dá)到掙脫結(jié)晶體所需能量后就會從結(jié)晶體上脫離，原來成功包合脂肪酸的晶體結(jié)構(gòu)被破壞，已包合的飽和脂肪酸被釋放出來，使得非包合相中PUFA得率下降。

通過對不同壓力下包合相晶體的熱力學(xué)性質(zhì)和形貌比較，初步說明了超高壓作用有助于促進(jìn)包合物晶體穩(wěn)定，也初步解析了高壓脲包法較傳統(tǒng)脲包法PUFA得率提高的原因。

3 結(jié) 論

超高壓脲包法富集模擬亞麻籽油PUFA較優(yōu)工藝為：尿素/MFA質(zhì)量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14，脲包混合液在20 ℃下冷卻30 min后，采用300 MPa超高壓處理20 min，此時非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.05%，得率為81.81%。對于模擬亞麻籽油MFA中PUFA的富集，超高壓脲包法所得非包合相中PUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（96.05%）與低溫（95.68%）或冷凍（97.41%）脲包法分離效果類似，但得率相應(yīng)分別提高28.92%和41.39%。超高壓脲包法富集亞麻籽油PUFA，其尿素包合物的晶面間距與冷凍脲包法無顯著性差異。當(dāng)處理壓力小于300 MPa時，隨著壓力升高，晶體的熱力學(xué)性質(zhì)趨于穩(wěn)定，六方晶系晶體熔融所需能量增加，且晶體形態(tài)更規(guī)則，晶體分布更密集，這也解釋了高壓脲包法提高PUFA分離效率的原因。