楊小斌，周愛梅*，王 爽，黃煒超，王 晉

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

藍圓鲹（Decapterus maruadsi）又稱巴浪魚，其生命周期短、生長速度快，在我國的年漁獲量高達60多萬t，是我國主要的經濟魚類之一[1]。但藍圓鲹肉質松軟、肉色暗，離水后極易發(fā)生腐敗及氧化變質，是典型的低值魚類。目前，將海洋低值魚加工成魚油并應用于食品中是低值魚高值化利用的主要途徑之一[2-3]。藍圓鲹魚油的主要成分為不飽和脂肪酸，相對含量高達59.57%，且主要為二十碳五烯酸（7.86%）、二十二碳六烯酸（16.76%），具有延緩衰老、降低血脂血壓、預防心腦動脈硬化和保護大腦及心臟等生理功能[4]。但魚油的高度不飽和性使其對氧氣、光和熱極其敏感，在自由基作用下極易發(fā)生氧化酸敗，降低其營養(yǎng)價值[5]。因此，選擇合適的穩(wěn)態(tài)化技術，有效保護魚油的生理活性并擴大其應用范圍，是開發(fā)魚油產品亟待解決的問題之一[6]。微膠囊技術可將富含多不飽和脂肪酸的魚油進行微膠囊化，在魚油周圍形成由壁材組成的保護層[7-8]，不僅能有效保護魚油，減少外界環(huán)境（如O2、pH值、水分、溫度等）的破壞，防止其見光分解、氧化、揮發(fā)[5,9]；而且能增加魚油的流動性和分散性；此外，魚油微膠囊的囊壁還能有效地控制魚油的釋放速率，提高其消化吸收率，延長產品貨架期[10-11]。微膠囊在其成囊的過程中，物質與物質之間會發(fā)生反應[12]，因此，深入探究微膠囊產品的微觀結構、光學性質、穩(wěn)定性、流變性及其在胃、腸道中的消化率和釋放性能，也是合理應用微膠囊的前提[6,13]。石燕等[12]利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法和計算機輔助分析法研究壁材乳清蛋白和阿拉伯膠在油脂微膠囊形成過程中的相互作用。牛廣財?shù)萚14]探討南瓜籽油微膠囊產品的穩(wěn)定性與緩釋性能，進行了高溫加速實驗及其在模擬胃液和腸液中的釋放性實驗。程超等[15]對鴨跖草黃酮類物質的微膠囊化及其微膠囊的釋放特性和穩(wěn)定性進行了研究。劉斯博[16]利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）對亞麻籽油微膠囊進行熒光染色觀察，更加直觀地了解微膠囊的釋放行為，從感官評價、熱量成分檢測、芯材的脂肪酸組成、粒徑分布、速溶性等方面考察自制微膠囊的性能。何慧子[17]采取熒光標記示蹤法間接測定共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）在動物消化道內的轉運情況，證明CLA在大鼠胃中釋放極少，但在進入小腸后釋放出大部分CLA，表現(xiàn)了較好的緩釋性能。

本研究從微膠囊的微觀結構與釋放性能出發(fā)，研究了藍圓鲹魚油微膠囊產品的形態(tài)結構、其在微膠囊形成過程中與壁材的相互作用及其體外模擬消化特性，對深入探究微膠囊制備條件-膜結構-性能的關系及其在應用環(huán)境中的動態(tài)行為變化規(guī)律具有理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍圓鲹魚油為實驗室自制，含有約60%的不飽和脂肪酸；明膠（食品級） 羅塞洛明膠（廣東）有限公司；阿拉伯樹膠、海藻糖（食品級） 美國唐瑞斯食品物料公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JOYN-8000噴霧干燥機 上海橋躍電子有限公司；LSM700 LSCM 德國Zeiss公司；90plus粒度儀 美國布魯克海文儀器公司；FJ200-S型數(shù)顯高速分散儀 上海嫩谷機電設備有限公司；VERTEX 70 FTIR儀 德國BRUKER公司；ZDJ-5型自動電位滴定儀 上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚油微膠囊的制備

通過前期實驗，從乳液乳化穩(wěn)定性、黏度和微膠囊產率3個方面綜合考慮，選取了明膠、阿拉伯膠及海藻糖作為壁材，確定其質量比為3∶5∶2。在水中加入質量分數(shù)40%壁材，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，隨之加入質量分數(shù)25%藍圓鲹魚油。通過高速分散、高壓均質形成均勻的乳液，最后采用噴霧干燥法制備微膠囊化魚油。

1.3.2 微膠囊包埋率的測定

1.3.2.1 魚油微膠囊表面油質量分數(shù)測定

稱取質量為m的魚油微膠囊產品，用30 mL石油醚輕微振蕩條件下準確浸提5 min，過濾。用5 mL石油醚洗滌濾渣，過濾，將濾液全部轉移至已恒質量（m1）的圓底燒瓶中，旋轉蒸干石油醚，105 ℃烘干至恒質量（m2）[18]。表面魚油質量分數(shù)按公式（1）計算。

1.3.2.2 魚油微膠囊總油質量分數(shù)的測定

用石油醚作為溶劑，準確稱取質量為m1的魚油微膠囊產品，加20 mL熱水，使樣品充分溶解后，再加入40 mL石油醚-乙醇混合液充分萃取，重復萃取2 次，合并萃取液并全部轉移至恒質量（m2）的圓底燒瓶中，萃取液旋轉蒸發(fā)大部分溶劑后再放入105 ℃烘箱中烘至質量恒定（m3）[19]?？傆唾|量分數(shù)按公式（2）計算。

微膠囊包埋率按式（3）計算。

1.3.3 魚油微膠囊微觀結構表征

1.3.3.1 SEM觀察

利用掃描電子顯微鏡（s c a n n i n g e l e c t r o n microscope，SEM）分析魚油微膠囊產品在形貌上的特點，闡釋產品性質和微觀結構的關系[20]。在貼有雙面膠的樣品平臺上撒上一定量的魚油微膠囊產品，用毛細管稍稍壓實，使部分粉末陷入雙面膠中，用刀片刮去表面粉末后，把多余的微膠囊吹凈，隨之置于離子濺射儀中在10 mA電流下噴金，使材料表面鍍上一層鉑膜，然后用SEM觀察微膠囊的形態(tài)結構。

1.3.3.2 LSCM觀察

采用LSCM觀察乳液及微膠囊的微觀結構[21]。配制質量分數(shù)0.02%尼羅紅（標記油脂）和0.1%尼羅藍（標記蛋白）溶解于1,2-丙二醇和水的混合溶液（體積比50∶1）中，混合均勻后于4 ℃下避光保存。觀測時，將40 μL混合染料加入1 mL樣品中，充分混合均勻后。選擇激發(fā)波長為488 nm的Ar離子和633 nm的He/Ne離子激光預掃描，采集熒光圖像[22]。

1.3.4 魚油微膠囊囊壁結構形成過程中的相互作用分析

1.3.4.1 FTIR分析

采用KBr壓片法，對樣品通過FTIR儀進行分析[23]。稱取約1 mg樣品與100 mg純KBr充分研磨混勻后放入模具中壓片，并以KBr空白壓片作參比，于4 000～400 cm－1進行掃描，儀器分辨率為4 cm－1，掃描次數(shù)32 次。分別對魚油、復合壁材、魚油微膠囊產品進行分析。

1.3.4.2 基于蛋白質二級結構含量變化的FTIR分析

對明膠、復合壁材和魚油微膠囊產品的FTIR吸收曲線進行二階求導[23]，根據(jù)光譜數(shù)據(jù)采用Peakfit 4.12軟件分析位于1 600～1 700 cm－1波數(shù)范圍屬于酰胺I帶特征峰的譜圖，先校正基線，然后用Gaussian去卷積，再用二階導數(shù)擬合，進行多次擬合使殘差最小，擬合系數(shù)大于95%。根據(jù)峰面積計算各二級結構含量，各子峰與二級結構的對應關系為：1 615～1 637 cm－1和1682～1700 cm－1處為β-折疊；1 646～664 cm－1處為α-螺旋；1 637～1 645 cm－1處為無規(guī)卷曲；1 664～1 681 cm－1處為β-轉角[24]。

1.3.5 魚油微膠囊體外釋放特性測定

1.3.5.1 體外消化液的配制

模擬口腔唾液：含有黏蛋白和各種鹽分的模擬唾液樣品采用Sarkar等[24]的方法制備。模擬胃液：取鹽酸23.4 mL，加100 mL水，配制成稀鹽酸溶液；然后取16.4 mL稀鹽酸溶液加800 mL水及10 g胃蛋白酶，搖勻后加水定容至1 000 mL，調節(jié)pH值至2.0。模擬腸液：準確稱取3.2 g磷酸二氫鉀，加入蒸餾水定容至250 mL，然后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8；稱取10 g胰酶，加入適量蒸餾水溶解，將pH 6.8的磷酸二氫鉀溶液與胰酶溶液混合均勻，加蒸餾水定容至500 mL，調節(jié)pH值至6.8。

1.3.5.2 pH-stat法測定FFA釋放率

參考Qiu Chaoying等[25]的方法。取20 mL微膠囊復原液加入20 mL模擬口腔唾液，使最終混合物含有質量分數(shù)3%魚油，整個體系的pH值為6.80?；旌暇鶆蚝笥?00 r/min的搖床中（37±1）℃保溫10 min。然后取20 mL模擬口腔唾液消化后的產物與模擬胃液按體積比1∶1混合，混合反應液用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至2.5后于200 r/min的搖床中（37±1）℃保溫2 h。取30 mL模擬胃液消化產物加入干凈燒杯中，用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至7.0，混合液加入含有3.5 mL 187.5 mg/mL膽汁鹽、1.5 mL CaCl2和NaCl溶液的模擬小腸液?；旌虾笳{節(jié)pH值至7.0，迅速加入2.5 mL脂肪酶開始反應，在消化過程中用pH計檢測pH值的變化，并用0.05 mol/L NaOH溶液滴定使其保持在pH 7.0，記錄所消耗的NaOH溶液體積。采用不加魚油的空載乳液作與上述相同的消化過程，測定NaOH溶液消耗量并從相應樣品中扣除，根據(jù)消化過程中消耗的NaOH溶液體積，按公式（4）計算樣品的游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）釋放率。

式中：V（NaOH）為滴定所用NaOH溶液體積/L；c（NaOH）為NaOH的濃度/（mol/L）；M魚油為魚油的平均摩爾質量/（g/mol）；m魚油為油相的質量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中所有數(shù)據(jù)均為至少兩次測定的平均值，并計算標準偏差，利用Origin 8.5軟件作圖，利用SPSS 7.0軟件Duncan’s multiple range test進行多組樣本間差異顯著性分析并進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 魚油微膠囊的結構特性表征結果

2.1.1 SEM觀察結果

圖1 SEM觀察魚油微膠囊形態(tài)結構Fig.1 Morphological structure of fi sh oil microcapsules observed by scanning electron microscope

微膠囊顆粒的結構狀態(tài)與微膠囊的流動性、保護芯材的能力密切相關。從圖1可以看出，所制備的藍圓鲹魚油微膠囊顆粒外形較圓整，基本接近球形，大部分顆粒表面光滑、致密、無裂痕，整個表面是連續(xù)的。

2.1.2 LSCM觀察結果

圖2 LSCM觀察魚油微膠囊形態(tài)結構Fig.2 Morphological structure of fi sh oil microcapsules observed by LSCM

LSCM是用于分析多組分聚合物共混體系形態(tài)結構最常用的方法。圖中綠色熒光為魚油部分，紅色熒光為蛋白質部分。從圖2a中可以看出，采用復合壁材包埋魚油形成的乳液，蛋白與多糖復合壁材已經將魚油完全包裹，形成了較為緊密、連續(xù)的球形囊殼結構，且為單核結構，與SEM觀察結果一致。從圖2b中可以看出，噴霧干燥后魚油微膠囊壁材集中區(qū)域熒光強度較為均勻，說明蛋白類壁材已均勻地分布于微膠囊的囊壁上，而標記油脂的綠色熒光很弱，幾乎沒有觀測到，說明壁材已經將魚油包埋起來。整體上看，微膠囊未出現(xiàn)大范圍聚集，包埋效果良好。

2.2 魚油微膠囊結構形成過程中的相互作用

由圖3中可以看出，明膠FTIR圖譜中3 435 cm－1處為O—H的伸縮振動吸收峰，1 634 cm－1處為C＝O或反對稱羧基伸縮振動，1 400 cm－1處為C—H彎曲振動。在復合壁材紅外光譜中3 387 cm－1處強而寬的吸收峰為復合壁材分子上O—H及N—H的伸縮振動吸收峰，2 940 cm－1處為—CH2對稱伸縮振動吸收峰，1 648 cm－1處的吸收峰是酰胺I帶中C＝O的伸縮振動吸收峰，1 090 cm－1處的吸收峰屬于壁材中多糖的C—O伸縮振動與環(huán)的振動。在藍圓鲹魚油紅外光譜中，3 012 cm－1處為脂肪酸雙酯雙鍵順式結構中的順式碳碳雙鍵C＝C—H的伸縮振動，說明魚油富含不飽和脂肪酸；2 928 cm－1和2 852 cm－1處為—CH2中C—H鍵反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動；1 745 cm－1處為脂肪酸酯鍵中C＝O的特征吸收峰。當壁材與芯材混合并經過噴霧干燥后，魚油微膠囊的FTIR圖譜既有壁材的特征吸收峰，又有魚油的特征吸收峰，并且在3 398 cm－1處出現(xiàn)強而寬的吸收峰，說明新物質共價交聯(lián)反應出現(xiàn)了新的N—H鍵，導致吸收峰強度增大[26]。魚油在3 012 cm－1及1 465 cm－1處的特征吸收峰經過微膠囊化后在魚油微膠囊FTIR圖譜中變得很弱，說明藍圓鲹魚油可能被3 種混合壁材包埋在內部，因此未出現(xiàn)強振動峰，由此可初步確定藍圓鲹魚油微膠囊的形成[27]。

圖3 FTIR表征魚油微膠囊結構形成過程的變化Fig.3 Changes of structure formation of fi sh oil microcapsule characterized by FTIR

為了進一步分析微膠囊化過程中含蛋白質的復合壁材形成過程結構的變化情況，利用去卷積方法對酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）進行擬合。結果表明，明膠的擬合系數(shù)R2＝0.994 61，復合壁材的擬合系數(shù)R2＝0.999 48，魚油微膠囊的擬合系數(shù)R2＝0.999 18，如圖4所示。

圖4 酰胺I帶的FTIR曲線和高斯曲線擬合圖譜Fig.4 FTIR curves and Gauss curve fi tting of amide I band

表1 酰胺I帶曲線擬合結果及譜圖指認Table1 Fitting results of amide I band curve and identif i cation of secondary structures

由圖4和表1可知，明膠、復合壁材及微膠囊化魚油產品中均包含β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲和β-轉角4 種結構。與純明膠相比，明膠經過與其他壁材復配形成復合壁材后，β-折疊含量增加了4.78%（P＜0.05），α-螺旋含量減少了1.94%（P＞0.05），無規(guī)卷曲含量減少了2.15%（P＜0.05），β-轉角含量減少了0.09%（P＞0.05）。明膠經過與其他壁材復合，并加入魚油制成魚油微膠囊后，β-折疊含量增加了2.68%（P＜0.05）；α-螺旋含量減少了1.33%（P＞0.05）；無規(guī)卷曲含量減少了2.80%（P＜0.05）；β-轉角含量增加了2.63%（P＜0.05）。同時，與未添加魚油的復合壁材相比，添加魚油后，α-螺旋含量增加0.61%，β-折疊含量下降了2.10%、無規(guī)卷曲含量減少了0.65%、β-轉角含量增加了2.72%，說明蛋白界面膜的彈性及延展性得到提升。分析其原因可能是魚油中含有較多極性基團或烯烴，疏水環(huán)境對于氫鍵的形成沒有影響，可能促進α-螺旋結構的形成，減少分子間氫鍵形成，從而有利于改善蛋白界面膜的彈性及延展性[28]。α-螺旋和β-折疊屬于相對規(guī)則的構象，多數(shù)存在于蛋白質的內部，這兩種結構中分布著較多的氫鍵，能與其他基團發(fā)生氫鍵鍵合，使得蛋白質的二級結構趨于規(guī)則，從而具有一定的剛性；β-轉角和無規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其他相互作用，使分子表現(xiàn)出較大的柔性；明膠與阿拉伯膠、海藻糖經過混合、溶解、均質乳化、噴霧干燥后，其剛性結構含量從65.66%分別增加到68.50%、67.41%，柔性結構含量從34.34%分別減少到31.50%、32.59%，說明壁材復配及魚油微膠囊化后蛋白質的二級結構趨于規(guī)則，剛性增加，有利于提高囊壁穩(wěn)定性。同時，研究中發(fā)現(xiàn)，純明膠蛋白質在微膠囊形成并經過噴霧干燥后，酰胺I帶向低波數(shù)方向移動，說明明膠蛋白質分子與海藻糖和阿拉伯膠的羥基發(fā)生了氫鍵締合作用，減輕了蛋白質受熱脫水作用導致的界面膜或囊壁結構不均勻收縮，有利于維持微膠囊結構的穩(wěn)定性[29-30]。

2.3 魚油微膠囊體外模擬消化特性分析

圖5 模擬消化過程中FFA釋放率隨時間的變化Fig.5 Release rate of free fatty acids during simulated digestion

圖5 為微膠囊化魚油在模擬體外口腔唾液消化10 min、胃液消化120 min后，在腸液中消化產物FFA的釋放曲線。開始時微膠囊產品FFA釋放率增加幅度較大，這可能是微膠囊表面殘留的表面油被消化所導致的；而在隨后相當長的一段時間內，魚油微膠囊的FFA釋放率增速放緩。在腸液中模擬消化120 min后，魚油的FFA釋放率最高僅達到72.62%，說明魚油微膠囊未能完全溶解釋放。究其原因可能是糖類和蛋白質類物質交聯(lián)作用組成的壁材具有較致密的結構，模擬口腔消化液及胃液對微膠囊囊壁的消化能力有限，而胃液只能初步消化糖類物質，對蛋白質類物質的消化能力有限，無法完全破壞微膠囊壁材[23]。因此，復合壁材具有較強的抗消化能力，能有效保護魚油直至在腸液中釋放。

LSCM可實現(xiàn)對特定物質的定性及定量觀察，對指定物質進行熒光染色，經過不同激發(fā)態(tài)激光光源的掃描，有利于更加清晰地觀察微膠囊在模擬體外消化實驗中的釋放行為及形態(tài)變化過程。圖6為LSCM反映的魚油微膠囊在模擬消化過程中微膠囊形態(tài)的變化。

圖6 模擬消化過程中魚油微膠囊形態(tài)變化Fig.6 Morphological changes of microcapsules during simulated digestion

如圖6所示，模擬消化前，魚油微膠囊呈完整包埋狀態(tài)，表面有少量的綠色熒光。在經過唾液消化后，魚油微膠囊發(fā)生一定的溶脹效應，體積增大，但由于魚油微膠囊在唾液環(huán)境中消化的時間較短，其保持了比較完整的形態(tài)，說明其在口腔唾液中穩(wěn)定。經過2 h的模擬胃液消化，魚油微膠囊形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分顆粒發(fā)生溶脹，油脂外溢在微膠囊壁材的表面。其原因可能是在蛋白酶的作用下微膠囊含有的蛋白成分發(fā)生水解，經初步消化，微膠囊出現(xiàn)部分分解，釋放出魚油[26]。圖6d表明，經過模擬腸液消化后，魚油微膠囊的粒徑明顯減小，且顯微鏡下微膠囊分布量明顯減少、顆粒變小，說明可能是魚油微膠囊發(fā)生分解，造成了微膠囊蛋白質骨架結構的深度降解。模擬消化實驗結果表明，微膠囊壁材雖然在模擬胃液、腸液環(huán)境的作用下不斷溶解，但囊壁仍然能保持完整的厚度均勻的結構，阻止芯材立即釋放，起到緩釋作用[13]；當微膠囊進入模擬腸液中時，堿性環(huán)境使其平均粒徑逐漸減小，加速壁材結構的瓦解[13]。隨著微膠囊顏色的改變，可以看出壁材保護結構在逐漸瓦解，魚油由中心向壁材表面遷移擴散，魚油逐步釋放。

3 結 論

本實驗制備的微膠囊化藍圓鲹魚油產品顆粒圓整、表面光滑，為單核的腔體結構；通過熒光標記油脂和蛋白，更加清晰地顯示了壁材包裹芯材結構的形成。對芯材、復合壁材FTIR圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)譜圖中同時出現(xiàn)囊芯和囊壁的特征吸收峰，證明了魚油被包裹在囊壁中。噴霧干燥后蛋白質的二級結構趨于規(guī)則，剛性增強，β-轉角和無規(guī)卷曲中存在氫鍵作用，柔性增強，有效地抑制了魚油在干燥成囊及貯存中的擴散逃離，有利于微膠囊結構的穩(wěn)定，對魚油的延緩釋放起到重要作用。體外模擬消化結果表明微膠囊化能夠有效抵抗口腔唾液、胃液環(huán)境對魚油的消化，提高魚油在腸液中的緩釋能力。用LSCM可觀察到模擬消化過程中微膠囊標記物顏色的改變，魚油由中心向壁材表面遷移，魚油逐步釋放。從微觀結構對囊壁形成過程的相互作用及模擬消化特性進行系統(tǒng)分析，對于檢驗微膠囊包埋效果、產品穩(wěn)定性及生物利用度具有一定意義。